響應面法優化鰹魚肽的復合酶酶解工藝及氨基酸評價

李慧凝,張明振,孟少珂,劉 霞,江曉路,王 鵬,張京良

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003; 2.中國海洋大學醫藥學院,山東青島 266003; 3.乳山市華隆生物科技股份有限公司,山東威海 264513; 4.中華人民共和國黃島海關,山東青島 266555; 5.青島海洋生物醫藥研究院,山東青島 266007)

鰹魚(Katsuwonuspelamis)又名炸彈魚,類屬硬骨魚綱(Osteichthyes),鱸形總目(Pereiformes),鯖科(Scombridae),鰹屬(Katsuwonus)[1]。據統計,目前全球鰹魚總捕撈量在200萬噸以上,大約占金槍魚總捕撈量的60%,是遠洋漁業重要魚類資源之一[2]。鰹魚運動量大,體內積累大量乳酸使肉質酸澀[3],目前大多以鮮食或加工罐頭為主,產品附加值低。

近年來,越來越多的研究發現海洋蛋白肽具有增強免疫力[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、降血糖[7]和降血壓[8]等多種生物活性,且小分子肽更易于被人體吸收利用[9],研究表明,海洋蛋白肽的制備方法主要以酶解法為主,酶解條件溫和,氨基酸不易被破壞,水解液中氨基酸含量高[10]。因此,利用海洋資源開發蛋白肽成為研究熱點之一。鰹魚蛋白含量豐富,是優質的海洋蛋白資源,目前利用鰹魚褐色肉、魚頭、下腳料等制備鰹魚酶解產物已有研究,楊龍方等[11]研究了利用堿性蛋白酶酶解鰹魚褐色肉的工藝條件;章葉江等[1]研究了利用木瓜蛋白酶和風味酶雙酶酶解鰹魚頭的工藝條件,獲得必需氨基酸含量為35%的水解液;何定芬等[12]優化堿性蛋白酶提取鰹魚內臟魚油的工藝條件,獲得高提取率的魚油,但酶解鰹魚肉制備鰹魚肽的研究較少。因此,本研究以鰹魚為原料,采用動物蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解鰹魚肉,通過單因素實驗和響應面法優化酶解工藝,分析研究鰹魚肽營養成分,為實現鰹魚高值化利用、開發鰹魚蛋白肽奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰹魚 青島麥島市場;堿性蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白酶、風味蛋白酶 2×104U/g,廣西南寧龐博生物工程有限公司;細胞色素C Mw 12384、抑肽酶Mw 6511.44、桿菌酶Mw 1422.69、還原型谷胱甘肽Mw 307.32、尿嘧啶Mw 112.09 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純。

DS-1 高速組織搗碎機 上海標本模型廠;SKD-100凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;pH2700酸度計 美國EUTECH公司;L-8900型氨基酸自動分析儀 日本日立集團;1260液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 新鮮鰹魚→去頭、去內臟,取其肌肉組織→組織搗碎機搗碎→調節料液比→調節pH→加酶→50 ℃保溫酶解→沸水浴滅酶10 min→冷卻至室溫→離心(6000 r/min,10 min)→取上清液即酶解液→活性炭脫色脫腥→納濾脫鹽→冷凍干燥→鰹魚肽樣品

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 蛋白酶篩選 從堿性蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白酶和風味蛋白酶中篩選兩種水解效果較好的蛋白酶,研究動物蛋白酶(D)與風味蛋白酶(F)比例(1∶1、2∶1、4∶1、8∶1)對水解度的影響。

1.2.2.2 加酶量對水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在料液比1∶4 (V/V)、酶解溫度50 ℃、酶解pH7.5、酶解時間2 h的條件下,考察加酶量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)對水解度的影響。

1.2.2.3 料液比對水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH7.5、酶解時間2 h的條件下,考察料液比(1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 V/V)對水解度的影響。

1.2.2.4 酶解溫度對水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4000 U/g、料液比1∶4 (V/V)、酶解pH7.5、酶解時間2 h的條件下,考察酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對水解度的影響。

1.2.2.5 酶解pH對水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4000 U/g、料液比1∶4 (V/V)、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h的條件下,考察酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)對水解度的影響。

1.2.2.6 酶解時間對水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4 000 U/g、料液比1∶4 (V/V)、酶解溫度50 ℃、酶解pH7.0的條件下,考察酶解時間(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h)對水解度的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,以水解度為響應值,以加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時間(D)為因素,根據Box-Behnken中心組合設計4因素3水平的響應面試驗,確定最優酶解條件。各因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 水解度測定 分別采用中性甲醛滴定法[13]和凱氏定氮法[13]測定水解液中氨基酸態氮含量和原料中總氮含量,并按照(1)式計算水解度:

式(1)

1.2.5 鰹魚肽分子量測定 參考邱娟等[14]的高效體積排阻色譜法并略作修改測定分子量。采用TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)色譜柱,以體積比40∶60∶0.05的乙腈:水:三氯乙酸為流動相,設置流速0.5 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長220 nm,將標準品和樣品上機分析,用GPC軟件進行數據處理,測定鰹魚肽分子量與分子量分布。

1.2.6 鰹魚肽氨基酸組成分析 將樣品用6 mol/L鹽酸在110 ℃下水解24 h,使用全自動氨基酸分析儀測定除色氨酸以外的氨基酸[15],色氨酸采用分光光度法測定[16]。

圖1 不同因素對水解度的影響Fig.1 Effects of different factors on DH

1.2.7 鰹魚肽氨基酸品質評價 根據FAO/WHO建議的蛋白質理想模式[17]和全雞蛋蛋白質模式[18],分別按照(2)(3)(4)計算氨基酸得分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(EAAI)。

AAS=待測測樣品氨基酸含量(mg/g N)/[FAO/WHO評分模式中同種中同種氨基酸(mg/g N)]

式(2)

CS=待測蛋白質氨基酸含量(mg/g N)/雞蛋蛋白質中同種氨基酸含量(mg/g N)

式(3)

式(4)

式中:n為必需氨基酸數目,a、b、c…h為鰹魚肽必需氨基酸含量(%);A、B、C…H為全雞蛋必需氨基酸含量(%)。

1.3 數據處理

采用SPSS 22進行數據處理,試驗重復3次,結果用平均值±標準差來表示;采用Design-expert 8.0進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

以水解度為指標,不同蛋白酶分別在最適條件下水解鰹魚肉的結果如圖1A所示,實驗結果表明動物蛋白酶的水解度最高為12.35%,風味蛋白酶水解度次之為11.81%,與其他蛋白酶相比具有顯著性差異(P<0.05)。由于蛋白酶專一性較強,故單一酶對原料酶解效果可能較弱。風味蛋白酶不僅含有風味物質可掩蓋苦味,而且兼具內外切酶,可切除多肽端基的疏水性氨基酸,降低苦味[19]。因此,從水解效果和風味方面考慮,選擇動物蛋白酶和風味蛋白酶為水解用酶。進一步研究動物蛋白酶(D)與風味蛋白酶(F)酶活比例對鰹魚肉水解效果的影響,結果如圖1B所示,當D/F為4∶1時,水解度最大,故選酶活比4∶1的復合酶進行后續實驗。

不同加酶量對鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1C,由圖1C可知,在1000～5000 U/g的范圍內,水解度隨加酶量的增加先顯著增大(P<0.05),當加酶量達到4000 U/g時,水解度增勢趨于平緩不再發生顯著變化(P>0.05)。這可能是由于隨著加酶量增大,酶與底物的接觸點增多,酶解效率提高;但當加酶量過高時,酶與底物充分接觸,底物水解完全。曹文紅等[20]利用風味蛋白酶在加酶量1000～5000 U/g的范圍內酶解牡蠣,結果顯示4000 U/g為最適加酶量,與本實驗結果一致。

不同料液比對鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1D,由圖1D可知,水解度隨料液比的增大先顯著增加(P<0.05),后略有下降。在料液比為1∶4 (V/V)時,水解度最大。這可能是由于料液比較低時,物料的粘稠度影響底物與酶的接觸,酶解效率較低,隨著料液比增大,酶與底物的接觸點增多,水解度增大,但當料液比增加到一定程度時,底物濃度過低導致酶解效率低,引起水解度下降[21]。

不同酶解溫度對鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1E,由圖可知,在40～60 ℃范圍內,50 ℃時水解度達到最大值,超過50 ℃時,水解度顯著下降(P<0.05)。這可能是由于隨著溫度增加,酶促反應速率逐漸增大,水解度增大,但當溫度過高時,酶的次級鍵斷裂,蛋白變性,水解度下降[22]。張典等[23]研究了利用胰蛋白酶酶解牡蠣的最適酶解溫度,發現50 ℃最佳,與本研究結果一致。

不同酶解pH對鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1F,由圖1F可知,在pH6.0～10.0的范圍內,水解度隨pH升高先略微增加后顯著降低(P<0.05),在pH7.0時,水解度達到最大值。這可能是由于在pH過高或過低時,一方面改變酶與底物的帶電狀態,影響兩者結合[24];另一方面影響酶的穩定性使酶遭受不可逆破壞。故選最佳酶解pH為7.0。

不同酶解時間對鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1G,由圖1G可知,水解度隨著酶解時間的延長先顯著上升(P<0.05),當酶解時間達到4 h,水解度增勢趨于平緩(P>0.05)。這可能是由于隨著時間的延長,底物逐漸被酶解,濃度降低,酶解過程基本趨于平穩,故選最佳酶解時間為4 h。

2.2 響應面分析

2.2.1 模型回歸與方差分析 根據單因素實驗結果與Box-Behnken試驗設計原理,以加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時間(D)作為影響水解度的主要因素,采用4因素3水平的響應面試驗確定復合酶酶解鰹魚肉的最佳工藝條件,試驗設計與結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Arrangment and results of response surface experiment

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 對實驗數據進行多元回歸擬合,建立水解度(Y)對加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時間(D)的多元二次回歸模型:

Y=20.37+1.12A-0.65B-0.68C+1.51D-0.30AB-0.55AC+0.93AD-0.26BC-0.43BD-0.36CD-0.44A2-2.06B2-1.73C2-0.11D2

表3 響應面回歸模型方差分析結果Table 3 ANOVA for response surface quadratic polynomial models

2.2.3 響應面分析 根據多元二次回歸模型作響應面的曲線圖。代表性曲面見圖2,由圖2可知,酶解溫度和酶解pH的等高線為橢圓且與坐標軸有一定角度,說明交互作用極其顯著;加酶量和酶解時間的等高線接近橢圓,說明交互作用顯著。

圖2 交互作用的響應面曲線圖Fig.2 Response surface plots for the interactions

2.2.4 最佳酶解條件的確定 在料液比為1∶4 (V/V)的情況下,經軟件分析得到最佳酶解條件為加酶量5000 U/g,酶解溫度49.17 ℃,酶解pH6.6,酶解時間5 h,最大理論水解度為23.74%,在此條件下進行驗證試驗測得水解度為23.15%±0.22%,與預測值相近,偏差較小,具有良好的擬合性。

2.3 鰹魚肽分子量測定與分析

鰹魚肽分子量測定結果見圖3,由圖3可知,鰹魚肽重均分子量為505 Da,鰹魚肽樣品中分子量在1000 Da以下小肽占比為91.06%,分子量在5000 Da以下小肽占比高達99.47%,表明經雙酶復合酶解后鰹魚肉蛋白質幾乎被完全降解為小分子物質。邱娟[14]等酶解牡蠣制備ACE抑制肽的研究發現,牡蠣經復合蛋白酶和堿性蛋白酶酶解后,分子量小于3000 Da的小肽占99.72%,與本研究結果相似。

圖3 鰹魚肽分子量與分子量分布Fig.3 Molecular weight and molecular weight distribution of Katsuwonus pelamis peptide

2.4 鰹魚肽氨基酸組成分析與營養評價

鰹魚肽氨基酸組成如表4所示,包含人體常見的18種氨基酸,氨基酸種類齊全,必需氨基酸含量豐富,必需氨基酸與非必需氨基酸的比為69.84%>60%[25],表明鰹魚肽符合FAO/WHO推薦的優質蛋白標準。鰹魚肽除含有豐富的營養價值外,鮮味氨基酸含量也極為豐富,6種鮮味氨基酸(Asp、Glu、Gly、Ala、Tyr、Phe)種類齊全,其中谷氨酸作為鮮味最強的氨基酸含量最高為13.52%。鮮味氨基酸作為呈味基料的基礎,使料液呈現出鮮美滋味[26]。由此可見,鰹魚肽是一種營養價值豐富、風味鮮美的優質海洋蛋白肽資源。

表4 鰹魚肽氨基酸含量分析Table 4 Amino acids contents of Katsuwonus pelamis peptide

表5 鰹魚肽必需氨基酸營養評價Table 5 Essential amino acids scores of Katsuwonus pelamis peptide

2.5 鰹魚肽必需氨基酸營養評價

鰹魚肽必需氨基酸的氨基酸得分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(EAAI)計算結果如表5所示:AAS第一限制性氨基酸為Met+Cys,AAS為0.98,評分最高的是Phe+Tyr,AAS為1.74。CS第一限制性氨基酸為Met+Cys,CS為0.57,評分最高的是Lys,CS為1.18。結果表明鰹魚肽的必需氨基酸組成與FAO/WHO建議的必需氨基酸模式及全雞蛋蛋白質模式的比例基本一致,符合人體健康的需求。EAAI是評價必需氨基酸營養價值的常用指標之一,鰹魚肽的EAAI為0.877，大于FAO/WHO規定的優質蛋白質EAAI值0.85,表明鰹魚肽必需氨基酸豐富,營養價值高,可作為開發海洋活性蛋白肽的優質原料。

3 結論

鰹魚作為一種捕撈量大的金槍魚品種,具有很大的市場潛力,為實現鰹魚高值化利用,提高鰹魚經濟價值,本實驗通過優化鰹魚肉復合酶酶解工藝,在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken響應面對鰹魚肽的加酶量、酶解溫度、酶解pH和酶解時間進行優化,確定了最佳酶解工藝條件為:加酶量5000 U/g,酶解溫度49.17 ℃,酶解pH6.6,酶解時間5 h,最大理論水解度為23.74%,對結果進行驗證,實際水解度為23.15%±0.22%,與響應面預測值吻合度較好;對鰹魚肽氨基酸組成研究,結果顯示鰹魚肽含有人體常見的18種氨基酸,必需氨基酸與鮮味氨基酸含量豐富,必需氨基酸含量與FAO/WHO提出的理想蛋白質模式和全雞蛋蛋白質模式的必需氨基酸含量基本接近,表明鰹魚肽是一種營養價值豐富且風味鮮美的優質蛋白資源,不僅可作為開發富含海洋蛋白肽等功能產品的優質原料,也可作為呈味基料開發海鮮調味料等產品,具有很高的應用價值。