膠體金免疫層析產(chǎn)品快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的評(píng)價(jià)與分析

葉秋雄,梁俊發(fā),張彬彬,林嘉健,彭 程,*,曾成柱,何麗媛

(1.廣州市食品檢驗(yàn)所,廣東廣州 511405; 2.廣東省測(cè)試分析研究所,廣東廣州 510070)

農(nóng)藥在果蔬種植過(guò)程中大量使用,在獲得高收益的同時(shí)也因農(nóng)藥殘留超標(biāo)造成食品安全問(wèn)題,對(duì)人類健康產(chǎn)生了巨大威脅。隨著人們生活水平的逐漸提高,社會(huì)各界越來(lái)越重視食品安全問(wèn)題,尤其是果蔬農(nóng)藥殘留問(wèn)題。現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有色譜法[1-3]、質(zhì)譜法[4-7]等,這些儀器分析方法靈敏、準(zhǔn)確,但也對(duì)昂貴儀器有著高度的依賴、移動(dòng)性差;另外,由于此類方法前處理復(fù)雜,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),需配備專業(yè)的檢測(cè)人員,檢測(cè)成本高等,難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)樣品進(jìn)行快速檢測(cè)的需要。

快檢技術(shù)在食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[8-10]。農(nóng)藥殘留快檢方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、成本低廉、適用性廣等特點(diǎn),在日常檢查、重大活動(dòng)保障、案件查辦中發(fā)揮著重要作用[11-14]。但市售的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)產(chǎn)品存在諸多問(wèn)題,如廠家準(zhǔn)入門檻低,研發(fā)水平、產(chǎn)品質(zhì)量、結(jié)果準(zhǔn)確度等參差不齊[15-18]。在投入使用前,有必要對(duì)其特異性、準(zhǔn)確性等參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前,快速檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法中,均參考《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》[19],但此類評(píng)價(jià)方法的盲樣設(shè)置不科學(xué),總量較少,評(píng)價(jià)指標(biāo)單一,不能全面科學(xué)地對(duì)快檢試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[20-25]。因此,本文在《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》的基礎(chǔ)上,建立一種盲樣檢測(cè)的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)產(chǎn)品評(píng)價(jià)方法,篩選出質(zhì)量穩(wěn)定可靠的快速檢測(cè)產(chǎn)品,為基層監(jiān)管部門在果蔬產(chǎn)品監(jiān)管方面提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毒死蜱(CAS:2921-88-2)、水胺硫磷(CAS:24353-61-5)、多菌靈(CAS:10605-21-7)、克百威(CAS:1563-66-2)、百菌清(CAS:1897-45-6)、氟蟲腈(CAS:120068-37-3)、啶蟲脒(CAS:135410-20-7)1000 mg/kg 中國(guó)農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;乙腈、丙酮、氯化鈉、甲苯、甲醇，分析純 廣州化學(xué)試劑公司;毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒等項(xiàng)目的快檢產(chǎn)品生產(chǎn)產(chǎn)家、實(shí)際批號(hào)、產(chǎn)品檢出限及其參比方法詳見(jiàn)表1;韭菜、菠菜、娃娃菜、生菜、蘋果 5種不同基質(zhì)的真實(shí)樣品由廣州市沃爾瑪番禺山姆會(huì)員店提供。

氣相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 配有電噴霧離子源(ESI)，美國(guó)AB SCIEX公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī) 上海赫田科學(xué)儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；KH-500B超聲波清洗器 成都一科儀器設(shè)備有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國(guó)Millipore公司；渦旋震蕩儀 美國(guó)Scientific Industries公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 取適量的毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇稀釋至濃度為2.0、1.0、10、0.4、100、0.4、4.0 mg/kg,-18 ℃冰箱中保存。

1.2.2 空白樣品的制備 由于不同果蔬樣品中的次生物質(zhì)不同,對(duì)膠體金免疫層析法檢測(cè)產(chǎn)品可能造成潛在的影響也不同,為了更全面評(píng)價(jià)快速檢測(cè)卡片的適用范圍,本實(shí)驗(yàn)選取韭菜、菠菜、娃娃菜、生菜、蘋果等5種果蔬作為基質(zhì)樣。對(duì)果蔬樣品進(jìn)行清洗,晾干表面水分后,采用表1中的參比方法進(jìn)行檢測(cè),確保購(gòu)買的果蔬為陰性樣品。

按照生產(chǎn)廠家(A、B、C、D)的快檢產(chǎn)品說(shuō)明書要求制備上述5種基質(zhì)樣品,樣品剪碎(1 cm2)混合均勻后,稱取2.0 g于50 mL離心管中,編號(hào)后置于冷庫(kù)(0～4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 加標(biāo)樣品的制備 取上述稱量好的空白基質(zhì)樣品,按照各快檢產(chǎn)品的檢出限(見(jiàn)表1),以1倍的檢出限濃度水平向空白基質(zhì)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)量分別為毒死蜱0.1 mg/kg、水胺硫磷0.05 mg/kg、多菌靈0.5 mg/kg、克百威 0.02 mg/kg、百菌清5.0 mg/kg、氟蟲氰0.02 mg/kg、啶蟲脒0.2 mg/kg,編號(hào)后置于冷庫(kù)(0～4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 加標(biāo)樣品的均勻性分析 為保證本次評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和規(guī)范性,需要對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行均勻性分析。本試驗(yàn)將“1.2.3節(jié)”制備的加標(biāo)樣品,分別采用各項(xiàng)目對(duì)應(yīng)的參比方法進(jìn)行檢測(cè),采用t-檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用的軟件為SPSS Statistics 22(美國(guó)IBM公司),通過(guò)t-檢驗(yàn)驗(yàn)證加標(biāo)樣品的均勻性。

1.3 快檢產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)分析

1.3.1 與參比方法的一致性分析 為考察毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒等產(chǎn)品的快檢方法與參比方法的一致性,對(duì)5種不同基質(zhì)的實(shí)際樣品,分別采用參比方法及快檢方法進(jìn)行測(cè)定,記錄各基質(zhì)樣品中7種農(nóng)殘檢測(cè)數(shù)據(jù),并采用卡方檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。卡方檢驗(yàn)具體可見(jiàn)顯著性差異(χ2)所示,一般:

式中:χ2-卡方;1-自由度(df);N12-陽(yáng)性樣品檢驗(yàn)為陰性結(jié)果的數(shù)目;N21-陰性樣品檢驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目。

χ2<3.84表示快速檢測(cè)方法與參比方法的陽(yáng)性確認(rèn)比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒(méi)有顯著性差異。

χ2>3.84表示兩種方法的陽(yáng)性確認(rèn)比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異。

相對(duì)準(zhǔn)確率計(jì)算公式為:

式中:RA-相對(duì)準(zhǔn)確率,%;N11-兩種方法均檢出陽(yáng)性結(jié)果數(shù);N22-兩種方法均檢出陰性結(jié)果數(shù);N1.-陽(yáng)性樣品數(shù);N2.-陰性樣品數(shù)。

1.3.2 特異性分析 為了評(píng)價(jià)快檢產(chǎn)品的特異性,本試驗(yàn)采用與農(nóng)藥殘留快檢產(chǎn)品目標(biāo)檢出物可能存在交叉反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為考察對(duì)象,濃度設(shè)置為10倍快檢產(chǎn)品檢出限,嚴(yán)格按照快檢產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 穩(wěn)定性分析 對(duì)同一品種規(guī)格的產(chǎn)品,每次評(píng)價(jià)采用3個(gè)不同批次的快檢產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)每個(gè)快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性,如生產(chǎn)廠家A的三個(gè)不同批次分別用A1、A2、A3表示。3批次同時(shí)滿足假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%、假陰性率應(yīng)≤5%的要求,說(shuō)明產(chǎn)品的穩(wěn)定性好,有1批次及以上不滿足上述要求,說(shuō)明產(chǎn)品的穩(wěn)定性差,未能通過(guò)評(píng)價(jià)。

表1 7種農(nóng)藥殘留快檢產(chǎn)品檢出限及參比方法Table 1 Detection limits and reference methods of 7 kinds of pesticide residue rapid detection kits

1.3.4 假陰性率和假陽(yáng)性率分析 為了評(píng)價(jià)不同快檢產(chǎn)品的假陽(yáng)性率、假陰性率,本試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)的盲樣由空白樣品和加標(biāo)樣品組成,每批次快檢產(chǎn)品檢測(cè)50份盲樣,其中至少包括20份不同基質(zhì)的空白樣品和20份不同基質(zhì)的加標(biāo)樣品,每個(gè)快檢產(chǎn)品檢測(cè)3個(gè)不同批次共150份盲樣,記錄其檢測(cè)情況,計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率。

假陽(yáng)性率為陰性樣品的陽(yáng)性結(jié)果比例,計(jì)算公式如下:

圖1 7種農(nóng)藥殘留的參比方法檢測(cè)譜圖Fig.1 Chromatograms of 7 pesticide residues by reference method

式中:pf+-假陽(yáng)性率;N21-檢出假陽(yáng)性結(jié)果數(shù);N2.-陰性樣品總數(shù)。

假陰性率為陽(yáng)性樣品的陰性結(jié)果比例,計(jì)算公式如下:

式中:pf--假陰性率;N12-檢出假陰性結(jié)果數(shù);N1.-陽(yáng)性樣品總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 22(美國(guó)IBM公司)及Microsoft Excel(美國(guó)Microsoft公司)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加標(biāo)樣品的均勻性分析

按照CNAS-GL003:2018對(duì)樣品的均勻性進(jìn)行驗(yàn)證,采用SPSS分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,查看t分布臨界值表,對(duì)每組數(shù)據(jù)的t值進(jìn)行比較。均勻性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2,經(jīng)查表,當(dāng)P=0.05時(shí),t95%,9為2.26,因此,每組數(shù)據(jù)的t值均小于t95%,9,說(shuō)明同一濃度水平的所有樣品間無(wú)顯著性差異,即制備的樣品均勻性較好,可作為下一步試驗(yàn)使用。

表2 加標(biāo)樣品的均勻性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of homogeneity of spiked samples

表3 參比方法與快檢方法對(duì)5種不同基質(zhì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results of 5 different substrates by reference method and screening method

2.2 與參比方法的一致性分析

用參比方法與快檢方法同時(shí)對(duì)5種不同基質(zhì)的實(shí)際樣品進(jìn)行7種農(nóng)藥殘留檢測(cè),7種農(nóng)藥殘留項(xiàng)目的參比方法檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖1,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,在參比方法中,韭菜的毒死蜱、菠菜的水胺硫磷和氟蟲腈、娃娃菜的多菌靈、生菜的百菌清和水胺硫磷均有檢出;在快檢方法中,以上果蔬有檢出的項(xiàng)目均為陽(yáng)性,兩者結(jié)果一致。且,χ2=0<3.84,即參比方法與快檢方法無(wú)顯著差異,故具有一致性,且相對(duì)準(zhǔn)確率均為100%。

2.3 產(chǎn)品性能分析

表4 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Cross reaction experiment results

2.3.1 特異性分析 本實(shí)驗(yàn)中,每種農(nóng)殘項(xiàng)目各添加10倍檢出限的潛在交叉反應(yīng)物,分別采用4家生產(chǎn)廠家的快檢試劑嚴(yán)格按照各自說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,4家生產(chǎn)廠家的毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒等試劑均未與潛在交叉反應(yīng)物發(fā)生反應(yīng),檢測(cè)結(jié)果均為陰性,特異性較好。

2.3.2 穩(wěn)定性、假陰性率和假陽(yáng)性分析 毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、克百威、百菌清、啶蟲脒膠體金競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析法快速檢測(cè)產(chǎn)品的盲樣檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5,部分盲樣檢測(cè)卡見(jiàn)圖2。由表5可知,14個(gè)快速檢測(cè)產(chǎn)品中有11個(gè)產(chǎn)品通過(guò)評(píng)價(jià)3個(gè)產(chǎn)品未通過(guò)評(píng)價(jià),通過(guò)率為78.6%。其中生產(chǎn)廠家A的毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、百菌清、啶蟲脒項(xiàng)目均通過(guò)評(píng)價(jià),假陽(yáng)性率和假陰性率符合規(guī)定要求,不同批次產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果較為一致,產(chǎn)品穩(wěn)定性較好;生產(chǎn)廠家B的毒死蜱項(xiàng)目有1批次產(chǎn)品假陽(yáng)性率為21%,超過(guò)規(guī)定值15%的要求,判定為未通過(guò)評(píng)價(jià),不同批次產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果相差較大,產(chǎn)品穩(wěn)定性較差,另外,啶蟲脒項(xiàng)目3批次產(chǎn)品的假陽(yáng)性率分別為4%、8%、4%,但均未超過(guò)規(guī)定值15%的要求,判定為通過(guò)評(píng)價(jià);生產(chǎn)廠家C的水胺硫磷項(xiàng)目有1批次產(chǎn)品假陰性率為14%,超過(guò)規(guī)定值5%的要求,另外,氟蟲腈項(xiàng)目3批次產(chǎn)品假陰性率分別為41%、33%、46%,超過(guò)規(guī)定值5%的要求,不同批次產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果相差較大,產(chǎn)品穩(wěn)定性較差,判定為未通過(guò)評(píng)價(jià);生產(chǎn)廠家D的克百威項(xiàng)目有1批次產(chǎn)品假陰性率為4%,但未超過(guò)規(guī)定值5%的要求,判定為通過(guò)評(píng)價(jià),另外,百菌清項(xiàng)目3個(gè)批次的產(chǎn)品穩(wěn)定性較好,未出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性,判定為通過(guò)評(píng)價(jià)。

表5 毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、 克百威、百菌清、啶蟲脒快檢試劑的盲樣檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of blind samples tested by chlorpyrifos, amiphos,fipronil,carbendazim,carbocarb, chlorothalonil,and acetamipridassay kits

續(xù)表5

圖2 毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、 克百威、百菌清、啶蟲脒部分盲樣檢測(cè)卡片F(xiàn)ig.2 Partial blind detection card of chlorpyrifos,amiphos, fipronil,carbendazim,carbocarb,chlorothalonil,and acetamiprid

3 結(jié)論

本次評(píng)價(jià)的14個(gè)快檢產(chǎn)品特異性較好,個(gè)別產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差,有2個(gè)快檢產(chǎn)品由于假陰性率不符合規(guī)定要求,未通過(guò)產(chǎn)品評(píng)價(jià),說(shuō)明這2個(gè)產(chǎn)品的檢出限達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求;1個(gè)快檢產(chǎn)品的假陽(yáng)性率不符合規(guī)定要求,未通過(guò)產(chǎn)品評(píng)價(jià),說(shuō)明個(gè)別企業(yè)為了迎合市場(chǎng)需求,實(shí)際檢出限遠(yuǎn)小于其標(biāo)示的檢出限,在實(shí)際監(jiān)管中使用該產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),將可能檢出大量的假陽(yáng)性樣品,增加監(jiān)管部門使用儀器驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的負(fù)擔(dān),影響監(jiān)管效率,達(dá)不到快速檢測(cè)的實(shí)際意義。

綜上所述,本文采用空白基質(zhì)加標(biāo)方式制備盲樣,并驗(yàn)證盲樣的均勻性;每個(gè)快檢產(chǎn)品隨意抽取3個(gè)不同批次,每批次產(chǎn)品均檢測(cè)50份盲樣,其中陰性樣品、陽(yáng)性樣品至少20份的技術(shù)評(píng)價(jià)方案,能夠科學(xué)客觀地對(duì)不同試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),進(jìn)而篩選出假陽(yáng)性率低、靈敏度高、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好的快速檢測(cè)產(chǎn)品;另外,通過(guò)建立快檢產(chǎn)品評(píng)價(jià)機(jī)制,有望促使快檢產(chǎn)品生產(chǎn)廠家不斷改進(jìn)技術(shù),提高產(chǎn)品性能,促進(jìn)快檢產(chǎn)品質(zhì)量提升,走創(chuàng)新發(fā)展道路。