棗種質資源果實cAMP和cGMP含量分析

薛曉芳,趙愛玲,任海燕,王永康,弓桂花,李登科

(山西農業大學(山西省農業科學院)果樹研究所果樹種質創制 和利用山西省重點實驗室,山西太原 030031)

棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZiziphusMill.)植物,原產我國,栽培歷史悠久,種質資源豐富,迄今已發現和記載的棗樹品種和優良類型近1000個[1-2]。棗果實營養保健價值極高,除含有糖、酸、氨基酸、礦物質等一般營養成分外[3-6],還含有多糖、類黃酮、三萜酸、生物堿、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、皂苷等多種生物活性成分[7-10],是傳統的滋補佳品。cAMP和cGMP統稱環核苷酸,是核苷酸的衍生物,具有第二信使的作用,參與廣泛的生理生化過程的調節[11-12]。研究表明,cAMP和cGMP通過調節基因表達參與抗過敏、提高免疫力、保肝護肝、抑制心血管疾病和癌癥等多種疾病的代謝過程[13-17]。

cAMP和cGMP是棗中極具特色的生物活性物質,自1980年Cyong等[18]首次在大棗中發現cAMP以來,許多學者相繼開展了棗樹不同組織部位、不同發育時期和不同品種間cAMP和cGMP含量的相關研究[19-24],結果表明,葉片、吊梗和果實三個部位相比,果實中含量最高;不同發育時期果實而言,全紅期含量最高;不同種質資源間含量差異較大[25-26]。孫忠親[27]和Fleming等[28]發現大棗的cAMP在180種中藥原料中含量最高。劉孟軍等[29]研究了棗、酸棗、蘋果、葡萄等14種園藝植物中cAMP含量,發現其在棗和酸棗成熟果肉中含量最高。綜上可知,棗果實富含cAMP和cGMP。然而,前人的研究僅選擇少數幾個品種對其開展研究。系統開展棗種質資源cAMP和cGMP含量評價,篩選cAMP和cGMP含量較高的種質資源,將為cAMP和cGMP功能產品研發時選擇原料提供參考。本研究首次從國家棗種質資源圃選擇204份棗種質資源,以各資源脆熟期果實為試材,利用超高效液相色譜法(Ultra-high Performance liquid chromatography,UPLC)分析cAMP和cGMP含量,闡明棗種質資源cAMP和cGMP含量特征,通過聚類分析初步篩選含量較高的資源,為cAMP和cGMP功能食品和藥物開發提供基礎原料,為棗cAMP和cGMP的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料 取自國家棗種質資源圃,選擇204份代表性棗種質資源脆熟期果實為試材(表1),采樣樹栽培條件和管理水平一致,每份種質選擇9株樹,每三株樹作為1次生物學重復,生物學重復三次,按照棗種質資源成熟期描述規范[30]采集脆熟期果實樣品,每份種質每個重復采集樹冠外圍大小和成熟度一致、無病蟲害的果實30個,置于低溫冰盒中,帶回實驗室進行處理;cAMP、cGMP 標準品,美國Sigma-Aldrich公司;甲醇、乙腈、磷酸 色譜純,德國默克(Merck)公司;磷酸二氫鉀 優級純,天津市天力化學試劑有限公司。

Acquity UPLC H-class超高效液相色譜儀 美國沃特世(Waters)公司;Acquity UPLC紫外檢測器 美國沃特世(Waters)公司;水浴鍋ZX-S24型 上海知信實驗儀器技術有限公司;3-18K型離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 果實樣品用不銹鋼刀片迅速切片、去核、混勻,液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。樣品提取采用熱水浸提法[19,31]。步驟如下:取20 g棗果實,加入80 mL超純水勻漿,將勻漿放入60 ℃水浴鍋中浸提48 h(期間每隔2 h振搖一次),然后10000 r/min離心10 min,取上清即為待測樣液,上機前用0.22 μm濾膜過濾。

1.2.2 測定方法 cAMP和cGMP含量的測定采用Waters UPLC法,紫外檢測器,環核苷酸分析專用色譜柱(ACQUITY UPLCRROligonucleotide BEH C18Column,1.7 μm,2.1 mm×100 mm),流動相A為甲醇,B為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀溶液,用磷酸調pH為2.38,A∶B=4∶96,流速0.25 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長254 nm,進樣量3 μL。用超純水溶解標準品制得1 mg/mL的標準品母液,然后分別將母液稀釋10倍、20倍、30倍、40倍、60倍、100倍、200倍后上機分析,以標準物質含量為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸并繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中cAMP和cGMP含量,以μg·g-1鮮重計。

1.3 數據處理

所有數據均平行測定3次,結果以平均值±標準差(M±SD)表示。試驗數據經Excel 2007整理后,利用SPSS18.0軟件進行變異分析、正態性檢驗、頻率分布及相關性分析,利用R 3.5.3軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 UPLC色譜

從UPLC色譜圖(圖1)可看出,在1.2.2色譜條件下,標準品色譜圖及棗果實cAMP和cGMP提取液色譜圖中目標峰分離度和峰形均較好。

2.2 線性關系

cAMP和cGMP的線性方程、相關系數和線性范圍見表1?？煽闯?在線性范圍內,相關系數R2均大于0.999,說明標準品的峰面積和濃度之間的線性關系較好。

表1 標準品的線性方程Table 1 Linear equations for standards

圖1 標準品和樣品的UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatogramFigure of standards and sample

2.3 204份棗種質資源cAMP和cGMP含量分析

將204份棗種質資源cAMP和cGMP含量按照cAMP含量從高到低的順序排列并編號得到表2,結合對cAMP和cGMP含量的變異情況分析(表3),可看出,cAMP含量的范圍在8.06～181.78 μg·g-1·FW,均值為58.01 μg·g-1·FW,變異系數為53.77%,高于平均含量和低于平均含量的種質分別有83份和121份,含量最高的種質溆浦香棗cAMP為含量最低種質灌陽長棗的22.55倍;cGMP含量的范圍在0.39～76.74 μg·g-1·FW,均值為22.82 μg·g-1·FW,變異系數為58.81%,高于平均含量和低于平均含量的種質分別有95份和109份,含量最高的種質溆浦香棗cGMP含量為含量最低種質延川狗頭棗的196.77倍。同一種質cAMP和cGMP相比,除嵊縣白蒲棗cGMP含量高于cAMP外,其余203份種質都是cAMP含量高于cGMP。這與前人的研究結果一致[19]。一般而言,變異系數高于10%即表示樣本間差異較大[32],本研究中204份棗種質果實cAMP和cGMP含量的變異系數都高于50%,說明供試種質資源間cAMP和cGMP含量差異較大。因此,進行種質間cAMP和cGMP含量分析,進而篩選含量較高的優特異種質資源具有重要意義。

表2 204份棗種質資源脆熟期果實cAMP和cGMP含量(μg·g-1·FW)Table 2 The cAMP and cGMP contents of crisp ripening fruit for 204 jujube germplasm resources

續表

續表

表3 204份棗種質資源cAMP和cGMP含量變異情況Table3 The variation of cAMP and cGMP contents in 204 Chinese jujube germplasm resources

2.4 204份棗種質資源cAMP和cGMP含量的分布情況

利用SPSS 18.0軟件對204份棗種質資源果實cAMP和cGMP含量分別進行K-S正態分布檢驗,結果表明,cAMP和cGMP含量的K-S值分別為1.324和1.316,Sig.值分別為0.060和0.063,二者的Sig.值均大于0.05,認為204份棗種質果實cAMP和cGMP含量均服從正態分布。從頻率分布直方圖(圖2)可看出,二者的頻率分布圖和正態曲線具有相似趨勢,cAMP和cGMP都是中低含量種質資源所占比例較大,頻率最大的含量范圍都位于正態曲線峰值左側,如cAMP在41.67～50.00 μg·g-1·FW范圍內的種質最多,占供試種質的14.22%(29份);cGMP在8.00～12.00 μg·g-1·FW范圍內的種質最多,占供試種質的16.67%(34份)。二者都是含量較高的種質資源較少,即頻率分布直方圖橫軸右側含量的資源頻率較小,例如,cAMP含量大于100 μg·g-1·FW的種質資源有20份,cGMP含量大于40 μg·g-1·FW的有19份,分別占供試種質的9.80%和9.31%。

圖2 不同棗種質果實cAMP和cGMP含量分布圖Fig.2 Distribution plot of the cAMP and cGMP contents in different Chinese jujube germplasm

2.5 cAMP和cGMP含量的相關性分析

對204份棗種質資源脆熟期果實cAMP和cGMP含量進行相關性分析(表4),結果表明,cAMP含量和cGMP含量呈極顯著正相關,相關系數高達0.941。推測二者在代謝過程中相互影響,其代謝過程及二者的影響機理有待進一步研究。

表4 204份棗種質資源cAMP和cGMP含量的相關性分析Table 4 The correlation analysis among cAMP and cGMP contents in 204 Chinese jujube germplasm resources

2.6 聚類分析

圖3 204份棗種質資源聚類圖Fig.3 Cluster analysis in 204 Chinese jujube germplasm resources map

以cAMP和cGMP含量為基礎,利用R語言軟件將204份棗種質資源進行系統聚類分析,在遺傳距離為4.5處將供試種質資源分為三大類群(圖3),同時統計每個類群包含的資源并計算各類群的cAMP和cGMP含量平均數(表5)。

第Ⅰ類群包含28份種質,為cAMP和cGMP含量都較高的資源,分別為:溆浦香棗、臨澤大棗、臨猗笨棗、根德大棗、延川跌牙棗、吳縣水團棗、稷山圓棗、梅花小鈴棗、永城圓紅棗、伏脆蜜、大荔干尾巴、南京鴨棗、定襄星星棗、豬腰棗、運城婆婆棗、新鄭齊頭白、泰安疙瘩棗、太谷壺瓶棗、六月鮮、新鄭小圓棗、太谷黑葉棗、連縣苦楝棗、南谷豐葫蘆棗、壺瓶酸、溆浦圓棗、衡陽珍珠棗、義縣木棗、蘭考圓脆棗,將其定義為高含量類群,該類群包含的種質最少;第Ⅱ類群包含71份種質,為cAMP和cGMP含量都中等的資源,將其定義為中等含量類群;第Ⅲ類群包含105份種質,為cAMP和cGMP含量都較低的資源,將其定義為低含量類群,該類群包含的種質最多,占供試種質的半數以上(51.47%)。因此,在提取、純化或開發cAMP和cGMP醫療保健功能產品時可選擇其含量較高的種質資源加以利用。

表5 不同類群包含的種質數及 cAMP和cGMP含量平均數Table 5 The average contents of cAMP and cGMP and contained germplasms in different clusters

3 結論

本研究采用UPLC法測定并分析了204份棗種質資源脆熟期果實中cAMP和cGMP含量,發現同一種質資源都是cAMP含量大于cGMP,不同種質資源間二者含量差異都較大,204份種質的cAMP和cGMP含量間呈極顯著正相關。通過聚類分析將供試種質分為三大類群,共篩選出含量較高的棗種質資源28份。其中第Ⅰ類群主要是二者含量都較高的種質,可以在功能性產品研發或cAMP和cGMP提取純化時優先選擇這些種質作為原料。第Ⅱ類群和第Ⅲ類群分別為含量中等和低含量種質,可采用分子生物學手段進一步研究不同類群種質含量差異的機理,挖掘控制cAMP和cGMP合成的關鍵基因并闡明其代謝調控機制,進而創制含量較高的新種質。