花旗參茶對小鼠免疫功能的影響

李雅琦,陳斯琪,余孝云,尚 強,3,伍 彪,聶 克,*

(1.廣東藥科大學中藥學院,廣東廣州 510006; 2.健康藥業(中國)有限公司,廣東珠海 519090; 3.國家中藥現代化工程技術研究中心,廣東珠海 519090)

西洋參又名花旗參,為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,具有補氣養陰、清熱生津等功效,臨床用于治療氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內熱消渴、口燥咽干等癥[1-2]。西洋參作為藥食兩用的中藥材,其飲片常被用來泡水當茶飲用,以達到養生保健等目的。

花旗參茶是用西洋參飲片經現代工藝提取后制成的顆粒劑,與飲片泡水服用相比,具有有效成分利用率高、便于攜帶、即沖即飲等優點。前期研究發現[3],花旗參茶具有較好的抗氧化活性,可保護乙醇誘導的小鼠急性肝損傷。為進一步闡明花旗參茶營養與保健功能的作用機制,本文采用原國家食品藥品監督管理總局《增強免疫力功能評價方法(征求意見稿)》中規定的正常小鼠實驗方案[4],觀察了花旗參茶對小鼠免疫功能的影響,并與西洋參飲片泡水服用對免疫功能的影響進行了比較。網絡藥理學作為一門新興學科,因其整體性和系統性的分析特點與中醫藥防治疾病的整體觀相吻合[5],近年來被廣泛應用于闡明中藥的藥效物質基礎、配伍規律、作用機制等研究[6-7]。本文同時利用網絡藥理學方法進一步探究了花旗參茶的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級BALB/c小鼠 300只,雄性,16～18 g,購自廣東省醫學實驗動物中心,實驗動物許可證號SCXK(粵)2018-0002;花旗參茶、西洋參飲片 健康藥業(中國)有限公司;刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA) 美國sigma公司;2-巰基乙醇 美國Gibco公司;新生牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;2,4-二硝基氟苯(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene,DNFB) 上海麥克林生物科技有限公司;印度墨汁 大連美侖生物;羧酸基修飾熒光微球 美國Invitrogen公司;無菌脫纖維綿羊血 北京索萊寶科技有限公司;都氏試劑 上海羽朵生物科技有限公司;SA緩沖液 北京雷根生物技術有限公司;乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒和MTT 碧云天生物技術有限公司;YAC-1小鼠淋巴瘤細胞 中國科學院上海細胞庫。

CLM-170B-8-NF型CO2培養箱 新加坡Esco公司;Eppendorf 5811型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;UV-2310 II型紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;CytoFlex流式細胞儀 澳大利亞Beckman Coulter公司;CKX41型倒置相差顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋參飲片泡水樣品凍干粉的制備 參考文獻[3],取西洋參飲片200 g,加適量沸水浸泡3次,每次5 min,合并三次浸泡液,過濾濃縮,冷凍干燥,得凍干粉40 g。

1.2.2 動物分組與給藥 小鼠分5批飼養,每批60只,分別用于:①遲發型變態反應;②小鼠碳廓清實驗;③小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球實驗;④ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化和NK細胞活性測定實驗;⑤抗體生成細胞檢測和半數溶血值HC50測定實驗。小鼠適應性飼養1周,隨機分為5組:陰性對照組、花旗參茶低、中、高劑量組和西洋參飲片泡水組,每組12只,各組分別灌胃給以蒸餾水、花旗參茶1.5、3、6 g/kg和泡水凍干粉0.1 g/kg(給藥劑量換算方法同文獻[3],成人體重以60 kg計,參茶成人每日推薦用量為9 g,則人的用量為0.15 g/kg體重,依據藥效研究中人與小鼠給藥劑量的換算方法[8],小鼠參茶給藥劑量分別相當于人用藥量的10、20、40倍,每3 g花旗參茶顆粒相當于原生藥0.55 g,則分別相當于0.275、0.550、1.100 g生藥/kg體重;西洋參飲片成人每日用量為3 g[1],則人用量為0.5 g/kg體重,小鼠給藥劑量相當于人用量的10倍,1 g凍干粉相當于5 g原生藥,則相當于0.500 g生藥/kg體重)。各組小鼠灌胃容積均為20 mL/kg,每天1次,連續灌胃4周。每周稱量動物體重,并根據體重調整灌胃劑量。

1.2.3 臟器系數測定 連續灌胃給藥28 d,稱量體重后脫頸椎處死小鼠,取胸腺和脾臟并稱重,計算臟器質量與體重的比值分別作為胸腺系數和脾臟系數。

1.2.4 細胞免疫功能測定

1.2.4.1 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗 灌胃至28 d,頸椎脫臼處死小鼠,無菌取脾,制備脾細胞懸液,用Hank’s液洗2次(1000 r/min,10 min),用完全培養基重懸細胞,調整細胞濃度為3×106cell/mL,分兩孔(1 mL/孔)加至24孔板中,試驗孔加入75 μL ConA液(0.1 mg/mL),對照孔不作處理。置于CO2培養箱5% CO2、37 ℃培養68 h后,每孔吸去上清0.7 mL,加入RPMI 1640培養液0.7 mL和MTT(5 mg/mL)50 μL,繼續培養4 h。培養結束后每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打至紫色結晶完全溶解后分裝至96孔板中,570 nm處測定吸光度,以試驗孔與對照孔的吸光度差值表示淋巴細胞的增殖能力。

1.2.4.2 DNFB誘導的遲發型變態反應 灌胃至23 d,每鼠腹部皮膚用硫化鋇飽和水溶液脫毛,范圍約3 cm×3 cm,用50 μL DNFB溶液(10 mg/mL)均勻涂抹腹部皮膚致敏。5 d后,取10 μL DNFB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩面進行攻擊。24 h后頸椎脫臼處死小鼠,用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重后計算耳腫脹率。

1.2.5 體液免疫功能測定

1.2.5.1 抗體生成細胞檢測 灌胃至28 d,腹腔注射2%綿羊紅細胞(Sheep red blood cell,SRBC)免疫小鼠,0.2 mL/只。5 d后,無菌取脾制備脾細胞懸液,調整細胞濃度為5×106cell/mL。向六孔板中加入含0.5%瓊脂糖的生理鹽水制備底層培養基。將含0.5%瓊脂糖的Hank’s液以0.5 mL/管加至50 ℃的恒溫試管中備用。取50 μL 20% SRBC及200 μL脾細胞懸液先后加入恒溫試管中,立即混勻,倒入六孔板中,鋪平后放入CO2培養箱中孵育1 h,每孔加入500 μL以完全培養基稀釋11倍的補體,繼續培養2 h,吸除上層液體,拍照,用Image J軟件統計每孔溶血空斑數,結果以空斑數/106脾細胞表示[9]。

1.2.5.2 半數溶血值HC50的測定 灌胃至28 d,腹腔注射2% SRBC免疫小鼠,0.2 mL/只。4 d后,眼眶取血制備血清,取SA緩沖液稀釋200倍后的血清1 mL于試管內,依次加入0.5 mL 10%SRBC,1 mL SA液稀釋9倍的補體。對照管以SA液代替血清。37 ℃恒溫水浴20 min,冰浴終止反應。2000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,加3 mL都氏試劑,同時取0.25 mL 10%SRBC加3.75 mL都氏試劑作為半數溶血對照管,充分混勻,靜置10 min后,以對照管作空白,540 nm波長處,測定各管吸光度。

1.2.6 單核-巨噬細胞功能測定

表1 花旗參茶對小鼠體質量的影響(g)Table 1 The effects of American Ginseng tea on the body weight of mice(g)

1.2.6.1 碳廓清實驗 灌胃至30 d,從小鼠尾靜脈注入以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,0.1 mL/10 g體質量。墨汁注入后2 min(t1)、10 min(t2),先后從眼內眥取血20 μL,立即加至2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,混勻。以0.1% Na2CO3溶液作空白,用分光光度計在600 nm波長處分別測得光密度值(OD1、OD2)。頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟和脾臟,稱重,以吞噬指數表示小鼠碳廓清能力[10]。

式中:t1、t2表示墨汁注入時間,min;OD1、OD2表示在t1、t2時間點取樣測得的光密度值

1.2.6.2 腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球實驗 灌胃至24 d時,每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC以激活小鼠巨噬細胞,4 d后頸椎脫臼處死小鼠,剪開腹部皮膚暴露腹膜,腹腔注射含5%小牛血清的Hank’s液3 mL/只,輕揉腹部20次,將腹膜剪開一個小口,吸取2 mL腹腔液經200目篩過濾至試管內,調整巨噬細胞數為4×105～6×105cell/mL。將稀釋好的細胞懸液以1 mL/孔加至6孔板中,加入1%BSA預調理過的熒光微球(1×107/板),置于CO2細胞培養箱內避光孵育90 min,用預冷的PBS緩沖液輕輕洗滌2次(1000 r/min,5 min),加入PBS緩沖液0.3 mL,用細胞刮刮下貼壁細胞,吹打均勻,經200目篩過濾后用流式細胞儀檢測,用CytExpert2.0軟件分析統計未吞噬熒光微球和吞噬不同數量熒光微球的巨噬細胞的比例,計算熒光微球吞噬百分率和吞噬指數[11]。

1.2.7 NK細胞活性測定 灌胃至28 d,脫頸椎處死小鼠,無菌取脾,制備單細胞懸液。經200目篩過濾至10 mL離心管中,Hank’s液洗2次(1000 r/min,10 min),棄上清,裂解紅細胞后加入8 mL Hank’s液,1000 r/min離心10 min,棄上清,用完全培養液調整細胞濃度為2×107cell/mL。按50∶1的效靶比將靶細胞(YAC-1細胞,實驗前24 h傳代)和效應細胞(脾細胞)各100 μL,加至U型96孔培養板中,靶細胞自然釋放孔和靶細胞最大釋放孔中均加入靶細胞和完全培養液各100 μL;背景空白孔中加入完全培養液200 μL。上述各項均設三個復孔,于37 ℃ CO2培養箱中培養3 h后,向靶細胞最大釋放孔中加入20 μL LDH釋放試劑,吹打混勻,繼續培養1 h。將培養板靜置10 min,每孔吸取100 μL加至平底96孔板中,同時加入LDH檢測工作液50 μL,避光反應30 min,在酶標儀490 nm波長處測定吸光度(OD)[12]。按下式計算NK細胞活性:

NK細胞活性(%)=(反應孔OD值-自然釋放孔OD值)/(最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值)×100

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 花旗參茶對小鼠體質量的影響

在實驗周期各時間點,花旗參茶低、中、高劑量組及西洋參飲片泡水組小鼠體質量與陰性對照組相比均無統計學差異(P>0.05)。說明花旗參茶和西洋參飲片泡水在實驗劑量范圍內對體重均無顯著影響。具體數值見表1。

2.2 花旗參茶對小鼠臟器系數的影響

胸腺系數和脾臟系數反映了免疫器官的發育情況,間接體現了機體的免疫水平[13]。由表2可知,給予受試物4周,花旗參茶三個劑量及參片泡水組小鼠的胸腺系數在數值上均有升高趨勢,但與陰性對照組比較均無統計學差異(P>0.05)。花旗參茶三個劑量及參片泡水組小鼠脾臟系數在數值上均有升高,其中僅花旗參茶高劑量組與陰性對照組比較有統計學差異(P<0.05)。說明花旗參茶可以在一定程度上提高脾臟系數。

表2 花旗參茶對小鼠臟器系數的影響Table 2 Effects of American Ginseng tea on the organ coefficient of mice

2.3 花旗參茶對小鼠細胞免疫功能的影響

有絲分裂原ConA刺激T淋巴細胞增殖產生效應T細胞,發揮細胞免疫功能[14]。遲發型變態反應是由效應T細胞介導的以單核細胞損傷為主的炎癥反應,炎癥反應的強度可間接體現細胞免疫能力[15]。

花旗參茶三個劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖能力均高于陰性對照組,其中花旗參茶中、高劑量組與陰性對照組比較具有統計學差異(P<0.01)。西洋參飲片泡水組小鼠脾淋巴細胞增殖能力也高于陰性對照組,但與陰性對照組比較無統計學差異(P>0.05)。

花旗參茶三個劑量組小鼠耳腫脹率均高于陰性對照組,且呈明顯的量效關系。其中花旗參茶中、高劑量、西洋參飲片泡水組與陰性對照組比較具有統計學差異(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.05)。具體數值見表3。

以上結果表明,花旗參茶可劑量依賴性地提高小鼠細胞免疫功能,其中參茶中劑量(0.500 g生藥/kg)的作用效果優于西洋參飲片泡水(0.550 g生藥/kg)的作用效果,說明在同等劑量下,花旗參茶對細胞免疫的增強作用優于西洋參飲片泡水服用。

表3 花旗參茶對小鼠細胞免疫功能的影響Table 3 Effects of American Ginseng tea on cellular immunity of mice

2.4 花旗參茶對小鼠體液免疫功能的影響

B細胞介導的體液免疫是機體特異性免疫的重要組成部分,抗體生成細胞數及血清溶血素含量是反應機體體液免疫能力的重要指標[16]。由表4可知,所有給藥組的溶血空斑數均高于陰性對照組,但只有花旗參茶高劑量和低劑量組的溶血空斑數與陰性對照組比較具有統計學差異(分別P<0.01,P<0.05)。與陰性對照組相比,僅花旗參茶高劑量組可極顯著提高血清溶血素水平(P<0.01)。說明只有高劑量的花旗參茶可以同時提高抗體生成細胞數及血清溶血素含量,具有增強體液免疫的能力。

表4 花旗參茶對小鼠體液免疫功能的影響Table 4 Effects of American Ginseng tea on the humoral immunity of mice

2.5 花旗參茶對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

單核-巨噬細胞是機體非特異性免疫防御的重要細胞,小鼠碳廓清實驗和腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球實驗是測定小鼠單核-巨噬吞噬功能經典實驗,其結果反映了機體非特異性免疫應答的能力[17]。

花旗參茶各劑量組小鼠的碳廓清能力均高于陰性對照組,其中花旗參茶中劑量組、高劑量組與陰性對照組比較具有極顯著差異和顯著性差異(分別為P<0.01,P<0.05)。泡水組小鼠的吞噬指數也高于陰性對照組,但無統計學差異(P>0.05)。

花旗參茶各劑量組小鼠腹腔巨噬細胞熒光微球吞噬百分率均高于陰性對照組,且呈明顯的量效關系,其中花旗參茶中、高劑量組與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)。西洋參飲片泡水組小鼠吞噬百分率也高于陰性對照組,但無統計學差異(P>0.05)。計算各組小鼠腹腔巨噬細胞熒光微球吞噬指數,與吞噬百分率結果相似,花旗參茶中、高劑量組與陰性對照組比較具有統計學差異(分別為P<0.05,P<0.01)。具體數值見表5。

以上結果提示,花旗參茶可通過增強單核-巨噬細胞的吞噬功能,提高機體非特異性免疫力,且在同等劑量下的作用效果優于西洋參飲片泡水服用。

2.6 花旗參茶對小鼠NK細胞活性的影響

NK細胞是介導非特異性免疫的主要效應細胞,具有抗原非特異性殺傷能力[14]。由表6可知,給予受試物4周,花旗參茶三個劑量組及西洋參飲片泡水組小鼠NK細胞活性在數值上均高于陰性對照組,其中僅高劑量組與陰性對照組比較具有統計學差異(P<0.01),表明高劑量的花旗參茶可增強NK細胞活性。

表5 花旗參茶對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響Table 5 Effects of American Ginseng tea on the monouclear macrophage function of mice

表6 花旗參茶對小鼠NK細胞活性的影響Table 6 Effects of American Ginseng tea on the NK cell activity of mice

2.7 作用機制分析

采用TCMSP數據庫[18](http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索花旗參茶的原料藥西洋參中的活性成分及作用靶點,以藥物口服利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選標準,得到9種活性成分,含β-谷甾醇和人參皂苷Rh2等(見表7)。

表7 花旗參茶增強免疫功能的物質基礎Table 7 The material basis of American Ginseng tea to enhance immune function

將化合物的作用靶點在Uniprot數據庫[19](https://www. uniprot. org)統一規范后得到56個藥物作用靶基因。以“Immunocompromised”和“hypoimmunity”為檢索詞,挖掘GeneCards數據庫[20](https://www. genecards. org)、OMIM數據庫(https://www. omim. org)和DRUGBANK 5.0數據庫[21](https://www. drugbank. ca)疾病相關靶點,共得到免疫力低下相關靶點1188個,其中藥物-疾病共同靶點20個。將共有靶點提交至STRING 11.0數據庫[22](https://string-db. org)構建蛋白互作網絡(PPI),利用Cytoscape 3.7.2軟件[23]實現可視化(見圖1),刪去游離的節點后,PPI網絡中共有19個節點,86條邊,平均節點連接度為8.6,平均局部聚類系數為0.74,其中對網絡影響最大的基因為CASP3(degree=16)、JUN(degree=16)和TNF(degree=14)。將藥物-疾病共同靶點輸入Metascape平臺[24](https://metascape.org),以P<0.01,最小計數為3,富集因子>1.5為條件,進行GO和KEGG功能富集分析,富集顯著性最強的通路如表8所示。西洋參對機體免疫力的調節作用對半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路的分子功能影響最大,涉及了4個基因;對凋亡的生物過程影響最大,涉及13個基因;對細胞中膜筏相關組分影響最大,涉及5個基因;對IL-17、NOD樣受體信號通路和細胞凋亡等信號通路有顯著影響。通過Cytoscape 3.7.2構建花旗參茶成分-免疫力低下靶點-通路網絡,并利用Network Analyzer分析西洋參調節機體免疫力的核心成分及核心作用靶點。結果表明,β-谷甾醇(degree=14,Betweenness Centrality=0.3844,Closeness Centrality=0.5738)和人參皂苷Rh2(degree=8,Betweenness Centrality=0.0476,Closeness Centrality=0.4430)為西洋參調控免疫功能的關鍵活性成分;CASP3、TNF、CASP8、NFKBIA和JUN為西洋參增強免疫力的重要靶點(見圖2)。

表8 花旗參茶增強免疫功能的作用機制Table 8 Mechanism of American Ginseng tea to enhance immune function

圖1 花旗參茶-免疫力低下靶點PPI網絡Fig.1 PPI Network of American Ginseng tea-immunocompromised targets注:節點大小和顏色亮暗代表節點連通度, 面積越大、顏色越鮮艷說明該節點越重要。

圖2 花旗參茶成分-免疫力低下靶點-通路網絡圖Fig.2 Network of Ginseng tea ingredients- immunocompromised targets-pathways注:圓形節點為花旗參茶的活性成分, 矩形為靶點,倒三角為相關通路;節點大小 代表節點連通度,面積越大說明該節點越重要。

3 討論與結論

目前的研究主要是針對西洋參成分的藥理作用研究,對花旗參茶的藥理藥效作用機制研究較少。據報道,西洋參中的皂苷類成分可有效增強雷帕霉素誘導的免疫力低下模型斑馬魚的免疫力[25];西洋參花多糖可增強小鼠巨噬細胞RAW246.7的免疫活性[26]。本研究從細胞免疫、體液免疫、單核巨噬細胞功能及NK細胞活性等方面全面探究了花旗參茶對小鼠特異性免疫及非特異性免疫功能的影響,結果表明,花旗參茶中劑量和高劑量均可顯著增強機體的脾淋巴細胞增殖、遲發型變態反應、碳廓清及腹腔巨噬細胞吞噬能力,高劑量可極顯著增加抗體生成細胞數(P<0.01),低劑量可顯著增加抗體生成細胞數(P<0.05),高劑量還可顯著提高脾臟系數(P<0.05),極顯著提高NK細胞活性和免疫小鼠體內血清溶血素水平(P<0.01),說明花旗參茶具有較好的免疫功能增強作用。另外,觀察到西洋參飲片泡水組(與花旗參茶中劑量所含生藥量相近)對免疫力的增強效果只與花旗參茶低劑量作用效果相當,說明在同等劑量下,其免疫力增強作用優于西洋參飲片泡水服用。

利用網路藥理學技術,通過數據挖掘,對花旗參茶增強免疫力的作用機制進行了探究。PPI結果顯示,Caspase家族蛋白相應基因中CASP3、CASP8、CASP9和CASP1基因均為PPI網絡的重要節點。Caspase8和Caspase9參與細胞凋亡的起始,Caspase3參與細胞凋亡的執行,炎性的Caspase1不直接參與凋亡信號的轉導,但與自身免疫性疾病有關[27-28]。網絡藥理學分析結果表明,花旗參茶調節免疫功能的活性成分為β-谷甾醇和人參皂苷Rh2。研究表明,β-谷甾醇及其糖苷在體內外均具有良好的免疫調節活性[29],它們可以靶向增殖輔助型T細胞(Th),促進Th1增殖從而促進白細胞介素(IL)-2和干擾素-γ的釋放,而對Th2的增殖及IL-4的釋放沒有明顯影響。此外,β-谷甾醇還可改善T淋巴細胞和自然殺傷細胞的活性[30-31],降低腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β水平發揮抗炎作用[32]。錢穎等[33]的研究表明人參皂苷Rh2通過促進天然免疫細胞的分化及免疫效應細胞的增殖,促進IL-2和TNF-α等Th1型細胞因子的分泌,提高放療及甲氨蝶呤誘導免疫低下小鼠的免疫力。研究發現,人參皂苷Rh2對阿爾茲海默癥和變態反應等炎癥相關免疫性疾病具有療效[34]。水溶性基團修飾人參皂苷Rh2后得到的衍生物Rh2-B2可通過抑制p38、c-Jun 氨基端激酶和細胞外調節蛋白酶的磷酸化及NF-κB通路的傳導,抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的過表達,改善脂多糖誘導巨噬細胞RAW264.7的炎癥反應[35]。

綜上,花旗參茶對小鼠免疫力具有較好的增強作用,本研究通過網絡藥理學分析發現,β-谷甾醇和人參皂苷Rh2等為花旗參茶調節機體免疫力的主要藥效物質基礎,其作用機制涉及IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路等炎癥相關信號及細胞凋亡信號通路,為我們進一步闡明花旗參茶的作用機制提供了新的思路。