含二硒聚碳酸酯自組裝膠束的制備及其性能

2021-06-16 09:10:12馬曉寧郎美東

功能高分子學報 2021年3期

馬曉寧，周沉，郎美東

（華東理工大學材料科學與工程學院，上海 200237）

聚碳酸酯由于其生物相容性、低毒性和可生物降解性在生物材料中應用廣泛[1,2]。通過將含有不同官能團單體的碳酸酯聚合，可以得到滿足不同需求的各種功能化聚碳酸酯[3]。為了獲得刺激響應型聚碳酸酯，許多刺激響應基團，如pH[4]、溫度[5]、光[6,7]、電子[8]、氧化還原響應等[9,10]被引入到聚合物鏈中。

硒元素（Se）最早發現于1817年[1]，是14種機體必需的微量元素之一。硒的化學活性和物理性質類似于同族的硫和碲[2]，但與同族的硫族元素（S）相比，硒元素原子半徑更大、電負性更低。二硒醚鍵是一種低結合能（172 kJ/mol）的動態化學鍵，在外界刺激下會發生復分解反應或斷裂。含二硒醚的聚合物因其在溫和的氧化還原、光照和輻照下的特異性刺激響應性而在納米技術和生物化學領域備受關注[11,12]，將二硒的響應氧化-還原特性與可降解聚合物相結合，通過控制二硒鍵的含量調整材料的刺激響應能力，可開發新的刺激響應材料。含二硒的生物聚合物材料由于缺乏有效的合成策略，一直發展緩慢[13]，直到2010年，Xu等[14,15]報告了一種含有二硒醚的聚氨酯及其在藥物載體上的應用，隨后Ma等[16]也報道了二硒嵌段共聚物在溫和還原條件下的反應。目前大多數硒聚合物是通過逐步聚合和自由基聚合的方法合成的，逐步聚合反應可控性較差，得到的硒聚合物往往呈寬分子量分布，若硒或二硒鍵不存在于聚合物重復單元內則硒含量難以提高；而自由基聚合以引發劑或偶聯劑的方式將硒引入聚合物鏈，且硒多以單硒鍵形式存在，因而難以調節硒含量，并且限制了以二硒鍵形式發揮化學特性的可能，所用單體多為乙烯基類，在單體的選擇上也受很大的限制。開環聚合（ROP）合成的聚合物通常結構清晰、相對分子質量可控、分散性低，通過調節單體能夠控制硒含量，可以克服自由基聚合和逐步聚合的弱點[17,18]，為合成二硒醚聚合物提供了一種可靠的策略。

本文利用實驗室開發的可用于ROP的含硒環狀碳酸酯單體，與普通碳酸酯單體進行“一鍋法”投料，通過調整配比進行聚合，得到了分子量適宜、分子量分布窄、硒含量可調、結構明確的兩親性功能化含二硒聚碳酸酯（mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC））。使用透析法、薄膜分散法、超聲乳化法制備了含二硒聚碳酸酯的膠束，從粒徑及粒徑分布和藥物包載等方面考察這3種膠束制備方法的優劣，并通過藥物釋放實驗初步驗證了含二硒聚碳酸酯膠束的刺激響應性釋藥能力。這些研究為含二硒聚合物的合成以及膠束制備的方法累積了經驗，也為其后續作為藥物載體的研發奠定了扎實基礎。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

溴乙醇、硼氫化鈉（NaBH4）、硒粉、四氫呋喃（THF）、二氯甲烷、氘代二氯甲烷（CDCl3）、碳酸二苯酯、三亞甲基碳酸酯（TMC）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、芘、谷胱甘肽（GSH）、5-氟尿嘧啶（5-FU，w=99%）：分析純，上海泰坦科技有限公司；聚乙二醇單甲醚（mPEG）：Mn=2 000，Sigma Aldrich；甲苯（鈉回流蒸餾干燥后使用）和乙醚：分析純，國藥試劑有限公司；脂肪酶（Lipase CA）：Novozym435，南京誠納化工有限公司，真空干燥48 h。

1.2 測試與表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）：德國Bruker AV400，氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內標；凝膠滲透色譜（GPC）：美國Varian PL-GPC 50 Plus，流動相為含0.01 mol/L溴化鋰的N,N-二甲基甲酰胺，檢測器溫度35 ℃，流速1 mL/min，標樣為聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀：美國Thermo Scientific Nicolet is50，溴化鉀壓片法制樣，波長范圍400～4 000 cm?1；動態光散射（DLS）儀：英國Malvern ZEN 3700，測試溫度25 ℃，波長設定633 nm；透射電子顯微鏡（TEM）：日本JEM 1400；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立S4800；熒光分光光度計：美國 Perkin Elmer LS-55 Lumine；紫外分光光度計：上海精科UV-Vis 765，測試溫度25 ℃，測定5-FU的吸光度，建立樣品濃度與吸光度關系的標準曲線，根據測得樣品的吸光度換算藥品濃度，波長為0～600 nm，測得5-FU的DMF溶液吸收波長為275 nm。載藥量（DL）和包封率（EE）按式（1）、（2）進行計算。

其中：m0為聚合物載體的質量；m1為包載藥物的質量；m2為投入藥物的總質量。

1.3 實驗步驟

1.3.1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的合成含二硒聚碳酸酯的合成路線如圖1所示。將2.0 g硼氫化鈉溶解于100 mL水中，加入4.0 g硒粉充分溶解后加熱至80 ℃反應2 h，將6.3 g溴乙醇溶解于80 mL THF后加入到體系中，50 ℃下反應6 h后，所得溶液用二氯甲烷萃取有機相，通過柱層析法提純后得到2,2′-二硒二乙醇。取合成的2,2′-二硒二乙醇1.7 g、碳酸二苯酯1.5 g及脂肪酶1.1 g于500 mL反應瓶中，加入400 mL新鮮無水甲苯于70 ℃下反應12 h后過濾除去脂肪酶，旋蒸除甲苯溶劑，所得固體產物通過柱層析法提純得到大環二硒乙醇碳酸酯單體MSeSe。將10 mL反應瓶抽烤3次后，在氬氣保護下加入mPEG 20 mg，MSeSe單體27.5 mg和TMC 61.2 mg，加入脂肪酶8.9 mg催化反應，以2 mL新鮮無水甲苯為溶劑，70 ℃反應24 h后過濾除去酶，由二氯甲烷稀釋并在乙醚中沉降獲得共聚物。不同嵌段組分共聚物的合成通過改變mPEG、MSeSe和TMC的投料摩爾比來調整。

mPEG用量為1 mol，投料比n (MSeSe)∶n(TMC)=1∶55、3∶44、5∶33的聚合物分別記作P1、P2、P3。

圖1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的合成路徑Fig. 1 Synthesis routine of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

1.3.2 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）膠束的制備（1）透析法：稱取聚合物25.5 mg和適量5-FU充分溶解于2.5 mL DMF中，將溶液緩慢滴入15 mL蒸餾水中，在800 r/min下攪拌3 h使有機相充分分散于水相，然后轉移入截留分子量3 500的透析膜中以去離子水為外液相進行透析[19]。定時更換外液相的水，更換次數不少于6次，每次間隔時間不低于6 h。透析完成后收集全部內液相并定容，得到mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的5-FU載藥膠束。空白膠束不加藥物以同樣方法制得。

（2）薄膜分散法：稱取聚合物 25.5 mg溶解于2.5 mL二氯甲烷中，充分溶解后裝進圓底瓶，中速旋蒸使有機溶劑二氯甲烷完全揮發，聚合物在燒瓶底均勻鋪開形成聚合物薄膜。加入蒸餾水25 mL，在 50 ℃水浴中速攪拌5 h使聚合物薄膜充分分散到水相中[20]，形成的水溶液質地均勻并散發標志性藍光，定容后得mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的空白膠束。

（3）超聲乳化法：稱取聚合物 25.5 mg溶解于2.5 mL二氯甲烷中，充分溶解后加入20 mL蒸餾水，將超聲探頭置于水油分界面進行超聲，功率250 W，每超聲60 s間歇15 s為1周期，進行4周期。過程中適當調整探頭位置使有機相充分被超聲分散于水相[21]。超聲后混合液從水油分界的體系變為均一的乳液體系，旋蒸去除有機溶劑后體系變為散發標志性藍光的膠束溶液，定容后得mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的空白膠束。

1.3.3 臨界膠束濃度（CMC）的測定采用芘熒光探針法來測定CMC以判斷聚合物自組裝成膠束的能力，具體操作如下：配制濃度為6.0×10?6mol/L的芘的丙酮溶液，向每個10 mL規格的棕色容量瓶內用移液槍加入1 mL溶液，將所有加入了溶液的棕色容量瓶置于 40 ℃烘箱中靜置過夜使丙酮完全揮發，芘留在瓶內在底部形成薄膜。將配制好的濃度為0.1～1×10?4mg/mL的一系列空白膠束溶液分別加入到容量瓶中并定容。將裝有膠束溶液和芘的容量瓶密封好，置于恒溫振蕩箱內在37 ℃下孵育12 h使芘充分分散并進入膠束疏水內核。使用熒光分光光度計測試配制好的系列膠束溶液，以熒光強度（I）的比值I337/I333對濃度作圖，突變點前后切線的交點對應CMC。

1.3.4 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）@5-FU膠束的響應性取一定量空白膠束溶液加入30 mmol/L GSH攪拌使其反應，隔一定時間取膠束溶液測定粒徑表征形貌，反應48 h后制樣通過透射電鏡觀察形貌。

1.3.5 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）@5-FU膠束的體外釋藥分別以pH=7.4的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、含濃度為2、10 mmol/L和30 mmol/L GSH的PBS緩沖液為外液相。取5 mL載藥膠束于截留分子量3 500的透析膜內并封緊袋口，置于25 mL外液相中，在溫度為37 ℃、振蕩頻率為100 r/min的恒溫振蕩箱中持續48 h釋藥。每間距一定時間取出外液相3 mL并增補3 mL新鮮緩沖液。取出的溶液通過紫外分光光度計測定5-FU的濃度。

2 結果與討論

2.1 共聚物的合成及表征

mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）是一種主鏈官能化的碳酸酯，它是先通過小分子與DPC的分子間成環反應制備出大環的二硒碳酸酯單體MSeSe，再通過mPEG引發MSeSe與普通的非官能化碳酸酯TMC的開環共聚得到聚合產物，通過控制引發劑和兩種單體的投料比，可以在適合的分子量內調整聚合物的官能化嵌段比例。mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的核磁共振氫譜和硒譜分別如圖2所示。由1H-NMR譜可見，PTMC鏈段在化學位移4.23和2.04處分別對應兩種化學環境的氫出現了3重峰和5重峰；含硒鏈段則在4.41和3.16處出現了兩種氫的質子信號峰。硒譜出現Se的單信號峰同樣證實了硒的化學環境[16]。

圖2 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的核磁共振譜圖Fig. 2 NMR spectra of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

通過調整投料比合成的不同官能化嵌段比例的共聚物的相對分子質量表征如表1所示。從表中可以看出，設計的共聚物嵌段比（Designed）與實際得到的嵌段比（Composition）基本符合，表明通過控制MSeSe與TMC的投料比可以有效控制共聚物的組成與硒含量，且合成的共聚物具有1.2～1.3的窄分子量分布，共聚物相對分子質量的均一性較好。

2.2 膠束的制備與表征

通過3種配比的mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的CMC來判斷其形成膠束的能力，結果示于圖3中，P1、P2、P3的CMC均較低，都在0.0045 mg/mL附近，這與含二硒聚碳酸酯無支鏈的直鏈結構以及硒的強疏水性質使共聚物嵌段的疏水性變強有關，反映了共聚物本身的性質。

通過不同制備方法制得的共聚物膠束經DLS測得的粒徑分布結果如圖4和表2所示。圖4（a）是透析法制備膠束的粒徑分布圖，可以看出膠束的粒徑整體上比另兩種方法更小，窄分布表明了粒徑良好的均勻性。隨著共聚物配比中硒含量的增加，膠束粒徑呈逐漸變小的趨勢，這可能與硒的強疏水性質有關，疏水性越強，膠束內核團聚越緊密，粒徑越小。圖4（b）是薄膜分散法制得膠束的粒徑分布，該方法得到的粒徑小而均勻，隨著硒含量增加膠束粒徑變小，這與透析法展現出的規律一致，但不同配比共聚物間展現出了較大的粒徑差異。圖4（c）是超聲乳化法制備的膠束粒徑，粒徑更大、分布更寬，不同共聚物配比的膠束之間沒有明顯的粒徑差異和變化趨勢，制得的膠束水溶液更偏向于白色渾濁乳液狀，而透析法和薄膜分散法能夠制得散發標志性“藍光”并有明顯丁達爾效應的膠束溶液。這證明本文合成的含二硒聚合物不適合用超聲乳化法來制備結構精確的膠束。

表1 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）的分子量表征Table 1 Molecular weight characterization of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）

圖3 mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC）膠束的CMC測算譜圖Fig. 3 CMC spectra of mPEG-b-（PSeSe-co-PTMC） micelles

圖4 不同方法制備的膠束的粒徑Fig. 4 Particle size of micelles prepared from different methods

表2 DLS 測定不同方法制得膠束的粒徑數據Table 2 Particle size of micelles prepared from different methods by DLS

圖5為3種方法制備的膠束樣品的TEM照片。如圖所示，由含二硒共聚物P1制得的膠束均呈球狀形貌，粒徑為幾十至幾百納米，這與DLS測定的粒徑結果相符。值得注意的是，尺寸小于30 nm的簡單膠束是通過兩親性質的自組裝形成的，而尺寸大于50 nm的聚合物球狀膠束被稱為“大型復合膠束”，這種膠束的形成機理目前被廣泛認可的一種解釋為“膠束聚集體”（MMA）機制，即大的復雜膠束由小型簡單膠束進行多步聚集而形成[22]。

圖5 P1膠束的TEM照片Fig. 5 TEM images of P1 micelles

表3為共聚物膠束的載藥量與包封率對比，總體來看膠束載藥量很低，這是因為5-FU是親水性藥物，而膠束內核的碳酸酯為疏水性，藥物與核的相容性較弱，經歷了長時間的透析后會增加5-FU的流失。3種方法中透析法制備的膠束載藥量最低，薄膜分散法最高，可見薄膜分散法制備的膠束適用于親水藥物包載。

表3 共聚物膠束的載藥量與包封率Table 3 Drug loading and encapsulate efficiency of copolymer micelles

2.3 膠束的響應性與釋藥

圖6是聚合物膠束在不同環境下的釋藥過程。由圖可見P1、P2、P3膠束在10 mmol/L GSH條件下的藥物釋放行為，以及P2膠束在2 、10、30 mmol/L GSH條件下的藥物釋放行為。在10 mmol/L GSH中，隨著P1、P2、P3中硒含量的增加，膠束對GSH的響應性逐漸增強，藥物釋放量逐步增加；P2膠束在不同濃度條件下，隨著GSH濃度逐漸增加，膠束藥物釋放量逐步增加。表明了在GSH刺激條件下，膠束發生了響應性釋藥行為，響應性與硒含量和GSH的濃度有關。P1膠束與GSH反應前后的膠束形貌經TEM觀察如圖7所示。