肉雞禽流感和新城疫免疫程序效果分析

陶天宇 程雪飛

（1，安徽省宣城市郎溪縣農業農村局動物疫控中心 241000；2，中國農業科學院上海獸醫研究所 200000）

高致病性禽流感（HPAI）致病原是正黏病毒科A 型流感病毒，該病毒主要傳播途徑為呼吸道，通常由禽類的分泌物、排泄物，受病毒污染的水等作為媒介傳播。發病高峰期為春冬交替季節。現已衍生出16 種H 亞型和9 種N 亞型，其中毒力最強、致死率較高的亞型有H5N1、H7N9。禽類感染后主要病理變化為外部冠及肉髯發紺水腫，頭部及臉瞼水腫，病禽病例解剖后內臟漿膜、呼吸道和消化道黏膜、心臟發生大面積點狀或斑狀出血，腎、肝、肺表面和切面可見大小不均的灰黃色壞死灶等。急性禽流感感染的一般成爆發性流行態勢，可出現短時間內雞群大量死亡，解剖時無明顯病變，致死率可達90%以上[1]。

雞新城疫（ND）是由副黏病科毒I 型病毒引起的禽類動物疫病，主要傳播途徑為呼吸道和消化道。該病全年易發，尤春秋高發期。目前該病毒未發現其他血清型。禽類感染后主要病理變化為呼吸困難[2]，張口伸頸發出咯咯喘鳴，冠和髯呈暗紅色和暗紫色，全身漿膜及呼吸道出血，淋巴結腫脹出血或壞死，腺胃黏膜和黏膜乳頭水腫出血，盲腸扁桃體及回腸黏膜出血或壞死等。急性新城疫死亡率可達90%～100%。

高致病禽流感（HPAI）和雞新城疫（ND）均為烈性動物傳染病，具有高傳染性、高致病性和高致死率，是嚴重危害畜禽養殖業的一類動物疫病。我國防控高致病禽流感和新城疫的舉措主要為肌肉注射接種疫苗，因此，疫苗的免疫程序是影響免疫效果的重要因素之一。為監測疫苗免疫效果，采集郎溪縣3 個大型817 肉雞場共計420 個樣本，采用凝血抑制（HI）法評估免疫效果，為本縣內各養殖場針對新城疫和高致病禽流感的防控工作提供方案與數據參考[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通離心機，微型振蕩儀，0.1～1ml 移液器若干，2～10ml移液器若干，移液器槍頭若干，96 孔V 型血凝反應板5 塊，50ml 燒杯若干，500ml 燒杯2 個，5ml 醫用注射器若干，10ml醫用注射器若干，生理鹽水750ml，3.8%檸檬酸鈉溶液30ml，新城疫和禽流感標準抗原和標準血清2 份[4]。

1.2 血清樣本采集

本次試驗所用的817 肉雞血清均來自郎溪縣境內的3 家大型肉雞場。新城疫與禽流感免疫程序：9 日齡肌肉注射新城疫—禽流感H5N1二聯滅活疫苗，0.2ml/只；17 日齡肌肉注射禽流感H7N9滅活疫苗，0.5ml/只；40 日齡新城疫—禽流感H5N1二聯滅活疫苗，0.5ml/只；58 日齡肌肉注射禽流感H7N9滅活疫苗，0.5ml/只[5]。

采血時間為75 日齡肉雞，樣本數量為每個養雞場120 份，共計420 份。翅下靜脈采血，每只雞采血2ml，標記密封后靜置30min，低速離心機4500rpm 分離血清，-18℃冰箱冷藏。

1.3 試劑準備

新城疫、禽流感標準抗原和標準血清均采購于洛陽萊普森生物信息科技有限公司。

阿氏（ALsever）液配制：稱量葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.42g，混合后加蒸餾水至100ml，散熱溶解后將pH 調至6.1，69kPa 15min 高壓滅菌，4℃保存備用。

1%紅細胞懸液配制（100ml）：準備2 只SPF 雞采血2～4ml與阿氏液1ml 混合后，放入裝10ml 阿氏液的離心管中混勻，經1500～1800rpm 離心8min，吸出上清液舍棄，沉淀物加阿氏液混合后，再經1500～1800rpm 離心8min，吸出上清液及沉淀的紅細胞上層白細胞膜舍棄，重復2 次以上過程后，加入阿氏液20ml，輕輕混合制成紅細胞懸液。取制備好的紅細胞懸液1ml，加入99ml PBS 溶液輕輕混合或用吸管反復吸打即可[6]。

1.4 檢測方法

本次新城疫和禽流感抗體檢測均采用血凝抑制實驗（HI）方法。新城疫檢測采用GB/T 16550-2008 《新城疫診斷技術》標準操作，禽流感檢測采用GB/T 18936-2003 《高致病性禽流感診斷技術》 標準操作。

1.5 結果判定

以完全抑制4 個HAU 抗原的血清最高稀釋倍數為HI 的抗體滴度。新城疫HI 抗體滴度≥5Log2 判定為合格，禽流感HI抗體滴度≥5Log2 判定為合格。

2 結果與分析

2.1 新城疫抗體效價分析

由表1 可知，A 場肉雞新城疫抗體合格率為95.8%，平均抗體滴度為8.4；B 場新城疫抗體合格率為91.6%，平均抗體滴度為8.3；C 場新城疫抗體合格率為91.6%，平均抗體滴度為8.6。A、B、C 三場75 日齡肉雞HI 抗體效價均大于70%，平均抗體滴度均大于8.0，95%滴度7.8～8.9。說明該新城疫免疫程序正確有效，抗體效價和平均抗體滴度均較高，具備良好的免疫保護能力。

表1 75 日齡肉雞新城疫抗體效價結果

2.2 禽流感H5N1-Re5 抗體效價分析

由表2 可知，A 場肉雞禽流感H5N1-Re5 抗體合格率為97.5%，平均抗體滴度為8.7；B 場抗體合格率為92.5%，平均抗體滴度為8.2；C 場抗體合格率為90.8%，平均抗體滴度為8.8。A、B、C 三場75 日齡肉雞HI 抗體效價均大于80%，平均抗體滴度均大于8.0，95%滴度8.1～9.2。說明該禽流感H5N1-Re5 免疫程序正確有效，抗體效價和平均抗體滴度均較高，具備良好的免疫保護能力。

表2 75 日齡肉雞禽流感H5N1-Re5 抗體效價結果

2.3 禽流感H7N9 抗體效價分析

由表3 可知，A 場肉雞禽流感H7N9抗體合格率為94.2%，平均抗體滴度為8.7；B 場抗體合格率為96.7%，平均抗體滴度為8.1；C 場抗體合格率為90.0%，平均抗體滴度為8.0。A、B、C 三場75 日齡肉雞HI 抗體效價均大于90%，平均抗體滴度均大于8.0，95%滴度8.1～9.2。說明該禽流感H7N9免疫程序正確有效，抗體效價和平均抗體滴度均較高，具備良好的免疫保護能力。

表3 75 日齡肉雞禽流感H7N9 抗體效價結果

3 討論

（1）本試驗采取的免疫程序適用于養殖量較大，雞舍較為密集的大型肉雞養殖場，理論上新城疫和禽流感抗體陽性率不小于70%即可說明免疫程序合理，對雞場可形成有效的保護力。但免疫效果易受雞群免疫應答能力、疫苗品牌、接種方式、雞舍衛生狀況及當地流行病態勢等因素影響。為保障雞群生物安全，大型的養殖企業（場）有必要定期對階段性免疫進行抗體監測抽查，及時控制疫病發生，防患于未然[7]。

（2）本試驗新城疫和高致病性禽流感滅活疫苗交替免疫。全程新城疫、禽流感H5N1免疫間隔為31d，禽流感H7N9免疫間隔為41d。高致病型H5N1、H7N9是我國禽流感流行的主型，并且仍有發展出新基因型的趨勢。將該型滅活疫苗一免和二免間隔適當加長3～7d 有助于雞群體液免疫引起良好的二次免疫應答，從而形成有效的保護力。