天然環烯醚萜類化合物提取及純化技術研究新進展

謝 玲，張學俊，陶 菡，賀揚潔，張靈麗

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室, 貴州 貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025)

0 引言

我國藥用植物種類繁多，種植面積和分布較廣，是國家獨有的種質資源。一方面，藥用植物的經濟價值和生態效益在農業發展中占有舉足輕重的地位，另一方面，充分利用藥用植物資源進行產品開發，是打開我國農業發展新局面的重要戰略舉措之一。目前，利用藥用植物活性成分開發的產品，在國際市場上具有較大的商業潛力和經濟效益。將農業與醫藥、食品、化妝品等行業有效結合，不僅有利于新產品開發，擴大資源利用，打開市場新格局，還可以實現“藥用農業”產業轉型升級。

藥用植物資源的利用是基于其天然產物的活性功能價值。環烯醚萜(Iridoids)是一類重要的次生代謝產物，具有廣泛的生物活性，是用于預防骨質疏松、“三高”、癌癥、帕金森病(PD)等疾病治療發揮藥效的主要基礎物質。目前主要應用于醫藥行業，基于它的抗炎、抗病毒、抗氧化等活性功能，有望在食品、保健品、果蔬保鮮和化妝品等領域應用。該類化合物在夾竹桃科、玄參科、茜草科、唇形科、馬鞭草科、龍膽科和木犀科等67種雙子葉植物中普遍存在[1-2]。在進行樣品分析檢測和產品開發前，往往需要采取必要的手段進行提取和純化以消除雜質干擾。本文對環烯醚萜類化合物的生物酶法(enzyme-assisted extraction，EAE)、表面活性劑輔助提取(surfactant assisted extraction，SAE)、離子液體輔助提取(ionic liquids assisted extraction，ILs)、超聲波輔助提取(ultra-sound-assisted extraction，UAE)、微波輔助提取(microwave-assisted extraction，MAE)、加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)、加壓液體萃取(pressurized liquid extraction，PLE)、超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)、逆流分離技術(countercurrent separation，CCS)、大孔吸附樹脂法和膜分離法等方法進行系統闡述，以期為這類物質的工業化提取、純化供以參考，使得相關藥用植物的開發利用促進“藥用農業”可持續健康發展，提高農民收入。

1 提取方法

1.1 生物酶提取

鄭陽[3]用纖維素酶從杜仲葉中提取杜仲醇，在料液比1∶25 g/mL、酶解溫度30 ℃、pH值7.0、酶用量1.0%、酶解4 h和提取1次時，杜仲總醇提取率0.235 7%。陳玉甫等[4]使用蛋白酶、果膠酶和纖維素酶分步連續酶解提取杜仲樹皮中的桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸和綠原酸4種活性成分，所得桃葉珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸3種環烯醚萜的含量分別為22.42、77.89和110.05 μg/g，提取率高于乙醇提取法和水提法。CHEN Gang等[5]加入離子液體輔助酶解從杜仲中提取京尼平，首先將纖維素酶加入到離子液體溶液中，調節酸堿度，稱取杜仲皮粉末置于酶-離子液體溶液中攪拌混勻，在液固比19.81 mL/g、纖維素酶濃度5.15 mg/mL、pH值5.0時，處理樣品140 min，京尼平含量0.64 mg/g。

單一酶解提取時，水解速度慢，加入某些特定的表面活性劑、離子液體可以增強酶活性。

1.2 表面活性劑輔助提取

GONDA S等[6]用毛細管電泳-膠束電動色譜法從不同提取物中提取桃葉珊瑚苷、梓醇、苯乙醇苷、毛蕊花糖苷和車前草苷，研究了不同電解質和表面活性劑類型對提取效果的影響。最終選擇15 mM四硼酸鈉、20 mM TAPS和250 mM DOC作為提取溶劑時，具有良好的穩定性和準確性，取得了較好的分離效果。LI Fajie等[7]用非離子表面活性劑輔助紅外光譜提取胡黃連苷I和胡黃連苷II，紅外功率200 W，10%非離子表面活性劑聚乙二醇單烷基醚(GX-080)，料液比1∶150，紅外輔助提取4 min，胡黃連苷I和胡黃連苷II的含量分別為6.898 3和39.298 2 mg/g。GUO J等[8]用SDS輔助微波提取杜仲皮中總環烯醚萜，在SDS濃度2 mg/mL、料液比1∶50、微波功率1 100 W、提取6 min時，總環烯醚萜提取率高達95%～105%。

表面活性劑的使用可有效替代有機溶劑，一方面緩解了環境污染嚴重的問題，另一方面可以減小生產成本，提高提取效率。

1.3 離子液體輔助提取

CAO Xiaoji等[9]用離子液體輔助超聲提取法與超高效液相色譜、電噴霧電離四極桿飛行時間串聯質譜結合，同時篩選胡黃連中的環烯醚萜苷、苯乙醇苷和葫蘆素苷，在最佳工藝為超聲波功率500 W、離子液體[BMIM][BF4]、料液比1∶500 g/mL和超聲30 min時，胡黃連苷I、胡黃連苷II、6-O-E-阿魏酸梓醇的提取率分別為2.84%、3.57%和2.20%，提取率比熱回流提取法高2～3倍。DU Kunze等[10]采用離子液體渦旋強化基質固相分散法，通過對離子液體類型、吸附劑類型、樣品與吸附劑比例、離子液體濃度和體積、研磨時間和渦流時間等參數進行優化，最后選用SiO2作為分散吸附劑，以濃度為6 mL 175 mM的[Domim]HSO4作為洗脫劑，山茱萸粉末中莫諾苷、狼芽菜苷、馬錢苷和山茱萸苷的含量分別為0.59%～0.93%、0.048%～0.056%、0.036%～0.470%和0.65%～0.74%，山茱萸粗品中的含量分別為1.57%～1.61%、0.061%～0.078%、0.54%～0.64%和0.16%～0.19%。

利用離子液體水溶液的兩親性，使其形成兩相體系可用作多功能分離板，作用于植物基質時與目標分析物形成離子-偶極、π-π共軛等相互作用，可以促進目標組分從基質中剝離[11]。

1.4 超聲波輔助提取

超聲波作用于水溶液中產生空化作用，撕裂水分子團形成大量空腔微氣泡，在植物組織縫隙中形成超聲微射流，使植物組織表面剝落和破裂，進一步擴大溶劑與基質的接觸表面積，使溶劑滲透到植物細胞中加快分析物溶出[12]。

1.5 微波輔助提取

CHENG Zhenyu等[16]用微波輔助提取法從龍膽中提取龍膽苦苷，提取溶劑為21.71% K2HPO4和40.72%乙醇，溫度80 ℃、微波功率806 W、料液比1∶11 g/mL和微波處理31 s時，龍膽苦苷含量65.32mg/g。WAKTE P等[17]用該方法從胡黃連中提取胡黃連苷I、胡黃連苷II，以水為提取溶劑，料液比1∶9 g/mL、溫度60 ℃和提取60 s時，其含量分別為41.23和6.12 mg/g。傅亞等[18]以玄參為原料，用微波輔助提取哈巴苷和哈巴俄苷，以水為提取劑，料液比1∶20 g/mL、微波功率600 W、溫度50 ℃和提取30 min時，總提取率1.117 2 %。WANG Xin等[19]用該方法從生地黃中提取益母草苷、梓醇，在最佳工藝參數為甲醇體積分數60%、溫度60 ℃、料液比1∶50 g/mL和提取10 min時，益母草苷、梓醇的含量分別為0.86和6.87 mg/g。

MAE不僅可以最大程度地提取目標化合物，還可以在短時間內快速均勻加熱，以最大程度地減少目標化合物在高溫和空氣中長時間暴露導致的降解[20]。

1.6 加速溶劑萃取

朱君燕等[21]采用加壓溶劑萃取法(PSE)提取山茱萸中環烯醚萜苷，在90%乙醇、壓力9 000 kPa、溫度60 ℃和保壓20 min時，總環烯醚萜苷提取率40.46 mg/g，高于超聲提取(39.95 mg/g)和回流提取(37.83 mg/g)。PSE法與超聲波法的提取率雖然相差不大，但PSE通過試驗優化及與其他下游技術聯用可以有效增加目標分析物提取量，且更易實現自動化；與索式提取相比，雖然兩者提取率相差小，但索式提取法用時是PSE法的8～12倍。李婷等[22]采用在線加壓溶劑提取-超高效液相色譜-離子肼-飛行時間質譜(Online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS)聯用技術實現了草蓯蓉化學成分的快速分析，樣品提取池由空預柱芯和正相硅膠組成，柱芯用濾膜密封后將其裝入預柱套內，通過0.1%甲酸水溶液自動觸發提取，提取溫度70℃、提取壓力約25 MPa、提取3 min時，鑒定了10個苯乙醇苷類、14個環烯醚萜苷類及21個苯丙醇苷類化合物。與UAE相比，該方法提取的樣品色譜峰響應值整體高于UAE。

PSE與常溫常壓下的溶劑提取技術相比，可以大大地提高提取效率和性能，主要在于高溫高壓下可以獲得良好的溶解度和傳質效果。

1.7 超臨界流體萃取

PATIL A A等[23]用超臨界CO2萃取法從胡黃連中提取胡黃連苷I和胡黃連苷II，萃取壓力30 MPa、溫度40 ℃和助溶劑濃度10%時，胡黃連苷I和胡黃連苷II含量分別為32.50±1.13和9.72±0.38 mg/g。LI Hui等[24]以杜仲種子為原料，比較超臨界CO2萃取和索式提取法對桃葉珊瑚苷提取效果的影響，萃取助溶劑為水-乙醇混合物(1∶3，v/v)，料液比1∶6 g/mL、萃取壓力26 MPa、提取溫度55℃、分離溫度30 ℃和CO2流速20 L/h時，提取100 g物料用時2 h，桃葉珊瑚苷提取率1.921%，而索式提取法提取10 g物料用時3 h，桃葉珊瑚苷提取率1.606%，超臨界CO2萃取法效果更好，目標化合物收率和能耗均低于索式提取法。

該方法集萃取和富集于一體，超臨界流體先選擇性地將極性、分子量和沸點不同的組分萃取后，通過改變壓力和溫度使分析物析出，從而實現分離純化。

2 分離純化方法

2.1 逆流分離技術

WANG Yarong等[25]用逆流分離法從梔子中提取環烯醚萜苷和藏紅花酸衍生物，先將樣品用HPD-100柱層析分離后，使用不同的溶劑體系進行分離純化，選擇正丁醇-乙醇-水(10∶1∶10，v/v)從餾分A中純化梔子苷、6β-羥基-京尼平苷和京尼平苷酸；乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1.5∶3，v/v)體系用于從餾分B中分離京尼平苷；己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶1∶5，v/v)用于從餾分C中純化藏紅花苷1、藏紅花苷2、藏紅花苷3和藏紅花苷4，流速8 mL/min，轉速600 r/min，其純度分別為91.7%、93.4%、92.5%、98.2%、94.1%、96.3%、94.1%和98.9%。根據目標化合物的結構和基質的復雜性，向正丁醇-水體系中加入非極性或極性溶劑改變溶劑體系的極性范圍。CHEN Bao等[26]以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶3，v/v)作為溶劑體系，在分離速度800 r/min和流速5 mL/min的條件下，從龍膽草根提取物中純化三氟氯苷，其純度98.9%。為了優化離子化合物的分配或降低溶劑系統的乳化作用，尤其是樣品溶液中含有酸性雜質時，可以加入少量有機酸，以縮短雙相溶劑系統沉降時間，提高固定相保留率，改善分離度。

在任何逆流分離技術中，最關鍵是溶劑體系的選擇。分配系數值(K)較小時峰分離度差，而K值較大時會導致過度的譜帶展寬。因此，選擇合適的溶劑體系可以提供適宜K值，使其達到“最佳點”以獲得最佳的分離效果。

2.2 大孔吸附樹脂法

張瑜等[27]考察了D-101、H-103、NKA-II、ME-1、ME-2、XDA-1、YWD03D、YWD07D和YWD09D共9種對總環烯醚萜苷比吸附量較大的樹脂對金銀花環烯醚萜苷類成分的分離純化效果，發現H-103型大孔樹脂的吸附和洗脫能力較好，用30%乙醇以2.0 BV/h的流速洗脫后，總環烯醚萜苷的洗脫率達90.0%。WANG Lu等[28]用AB-8大孔吸附樹脂法和高效液相色譜-電噴霧串聯質譜聯用技術與離子遷移譜技術結合，從梔子提取物中分離得到了環烯醚萜類苷等71種化合物。蔣麗娟等[29]用SP825大孔吸附樹脂結合硅膠柱色譜法分離純化玄參哈巴苷，其純度達98%以上。沈燚等[30]篩查了AB-8、ADS-17、D101、HPD400、HPD600、HP20、S-8、SP850、XDA-1和XDA-16等極性和非極性樹脂對巴戟天環烯醚萜苷類成分(MOIG)的吸附、解吸附作用，結果表明，XDA-1型大孔樹脂效果最佳，其含量達54%以上。蘇婭等[31]以30%乙醇作為洗脫劑，用D101型大孔樹脂純化肉蓯蓉毛蕊花糖苷，其含量為25.1%。

該方法在天然產物分離純化中較為常用，經大孔樹脂處理后不僅可以通過減少提取物中的雜質來提高制劑的內在質量，還可以降低產品的吸濕性，增強提取液穩定性，此外，還能去除重金屬、農藥殘留等有害成分，從而提高制劑的安全性。

2.3 膜分離法

膜分離中常用的膜分離技術包括反滲透(RO)、超濾(UF)、電滲析(ED)、納濾(NF)、膜蒸餾(MD)和滲透汽化(PV)[32]。郭立瑋等[33]用超濾膜法考察生物堿和環烯醚萜類物質的透過率及其定量構效關系，結果表明，梔子苷等4種環烯醚萜類化合物的透過率<50%，可能是因為料液組分之間存在透過競爭。在膜分離過程中，梔子苷這類小分子物質易被大分子包裹而被截留。徐益清等[34]以復方板藍根水提液為研究對象，選用200和50 nm孔徑陶瓷膜分離哈巴俄苷、甘草苷等6種有效成分，平均遷移率分別為85%、83%。宋逍等[35]用膜分離法純化穿山龍薯蕷皂苷，最佳工藝參數為料液濃度2 g/L、過膜溫度30 ℃和過膜壓力0.8 MPa，其平均轉移率44.88%。

盡管膜分離法具有諸多優點，但仍存在以下問題。膜污染導致通量下降，膜的清洗和再生是應用過程的關鍵。膜材質對提取液中某些成分的吸附，導致轉移率下降。由于提取液組分體系復雜，淀粉、蛋白質和果膠等高分子物質與小分子有效組分以膠體或水合物的狀態存在，甚至被大分子物質包裹，在膜分離過程中產生空間位阻，導致目標化合物透過率低。

3 各方法優缺點及其他方法

對以上各方法的優缺點進行歸納總結，以期為環烯醚萜類化合物的提取及純化方法選擇提供精準參考，結果如表1所示。

表1 各方法優缺點比較Tab.1 Comparison of advantages and disadvantages of these methods

除以上提取及純化方法外，如分子印跡固相萃取技術(MISPE)、硅膠柱色譜法和半制備色譜技術等方法也可用于分離環烯醚萜類化合物。CHEN Lizong等[36]采用分子印跡固相萃取技術分離純化梔子苷、京尼平苷酸等5種環烯醚萜苷(IGs)，以京尼平苷為模板，α-1-烯丙基-2-N-乙酰氨基葡萄糖(NAP)作為新型水溶性功能單體，制備了對環烯醚萜苷具有特異分子識別能力的親水性分子印跡聚合物。萃取分離前將5.0 g MIP裝入固相萃取柱中，梔子提取物以20.0 mL/min的流速加載到MISPE上，乙酸乙酯/乙醚(3.0 mL，pH值8.5)以18.0 mL/min的流速洗脫，采用HPLC-DAD進行檢測分析，所得5種環烯醚萜類化合物(IGs)的純度均>98%。該方法分子印跡聚合物的制備，以及確定最佳比例的模板/功能單體、交聯劑/功能單體的過程復雜且耗時。SAIDI I等[37]用硅膠柱色譜結合制備型HPLC從垂花琴木的花中分離得到了一種新的環烯醚萜苷(Spinomannoside)。

4 結束語

從環烯醚萜類化合物提取及純化方法的發展進程上看，單元操作有時不能滿足需求，需要采用多種方法聯用技術。通過使用力、聲、微波和電場等多能量場來提高傳質速率的文獻報道日漸增多，可以有效縮短樣品制備的時間，如微波-熱壓場，超聲強化微波輔助提取和ASE等。另一方面，通過除雜、分離、分級和富集一體化戰略技術可以替代傳統方法中的多步驟單元操作，更省時，更易實現自動化，且能有效避免熱不穩定性組分的降解損失，如SFE、膜分離法。目前，很多提取方法仍然停留在實驗室階段，需要不斷完善提取方案，朝著適應規?；a的方向發展，以最大限度提高產品的附加值。