亞基水平上大豆蛋白凝膠性的研究進展

付洪玲，范宏亮，呂 博，孫 賀，單單單，于寒松,

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118；2.國家大豆產業技術體系加工研究室，吉林長春 130118；3.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

近年來，大豆以其“全蛋白質”成分，富含多不飽和脂肪酸和有益的生物活性成分而聞名[1]。隨著人們對現代食品加工技術的要求以及消費者健康觀念的轉變，大豆蛋白被廣泛用作食品加工原料，用來提高食品的高營養價值和改善產品質地特性[2]，如大豆蛋白替代動物蛋白促進了混合蛋白產品的開發[3]，或添加到烘焙食品中以提高產品的持水性，或利用其乳化性作為表面活性劑將其應用在冷凍食品中[4]。另外，大豆蛋白的功能特性也備受研究者的關注，比如大豆蛋白在降低膽固醇含量，降低高血脂和在心腦血管疾病中的功能作用已被證明[4-8]。

一直以來，大豆蛋白的凝膠性備受關注[9]，主要表現為蛋白分子之間的交互作用，大豆蛋白質分子受熱，結構展開，暴露出分子內部的疏水基團，并通過疏水相互作用、靜電相互作用、氫鍵相互作用或者二硫鍵進行交聯，形成空間網絡結構[10]。很多國家已經對大豆蛋白的分子結構及凝膠特性進行了大量的研究，日本和加拿大已經開發出多種高凝膠型的大豆蛋白產品，而我國在專用大豆蛋白產品的研究上起步較晚，也多停留在通過改變處理條件改善加強其凝膠特性。

大豆蛋白亞基之間的解離締合反應在凝膠受熱變性過程中起決定性的作用[11]。有研究結果顯示，β-伴大豆球蛋白（簡稱為7S球蛋白）和大豆球蛋白（簡稱為11S球蛋白）不同比例會影響產物的最終品質，這些可以通過育種來開發適用于不同類型食品加工的品種[1]。此外，不同的亞基組成也會對加工性能產生差異[12]，Yamagishi等[13-14]研究大豆11S球蛋白的凝膠化過程，結果表明其酸性亞基的聚合會引發或加速大豆球蛋白的熱凝膠形成。Milica等[15]對不同基因型大豆分離蛋白的亞基組成及其凝膠性進行系統研究，表明β亞基的基因型制備的凝膠顯示出較低的彈性。Amir等[16]的研究表示大豆球蛋白亞基的類型也影響豆漿的聚集行為。目前并沒有徹底的從亞基的角度系統的深入闡述凝膠化機理，這一難點將會成為大豆蛋白加工研究的重中之重。因此，研究亞基水平上大豆蛋白的凝膠特性對探索大豆蛋白凝膠形成體系具有極其重要的意義，為大豆蛋白產品的開發提供理論依據。

本綜述基于大豆蛋白亞基組成對凝膠形成的影響，從蛋白組成、化學結構、以及亞基缺失類型大豆品種等方面對其凝膠特性的影響進行歸納總結，并分析了蛋白熱聚集行為的圖解描述，以期探究亞基組成對大豆蛋白凝膠體系的影響作用，為大豆蛋白功能性質的改善提供理論依據。

1 大豆蛋白的組成和化學結構

大豆在平均干物質的基礎上含有40%左右的蛋白質和20%的脂肪[4,17]。經過低溫脫脂，堿溶酸沉的方法獲得大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）[18]。SPI是各種蛋白質的混合物，按照其沉降系數可分為2S（15%）、7S（34%）、11S（42%）和15S（9%）四種蛋白質類別[18-19]。7S球蛋白和11S球蛋白占70%以上[20]，其也是影響大豆蛋白成分加工功能的兩種主要大豆蛋白。盡管7S球蛋白和11S球蛋白的四級結構互不相同，但由于它們的氨基酸序列具有部分同源性且蛋白質水解模式有限，因此它們被認為是源自共同祖先基因，已經通過X射線晶體學證實了這種假設[21]。另外，根據研究表明，因為品種不同，大豆蛋白的7S/11S的比值范圍在0.5～1.3之間，其加工特性表現出較大差異[22]。

7S球蛋白是一種三聚體糖蛋白（150～200 kDa），主要由α（72 kDa）、α′（76 kDa）和β（53 kDa）三種亞基組成。這三種亞基主要通過疏水相互作用力以不同的排列組合方式以平面三角形緊密堆積的形式形成7S球蛋白分子，Thanh[23]根據7S球蛋白及其亞基的分子量，將三種亞基隨機組合分為B1，α′ββ；B2，αββ；B3，αα′β；B4，ααβ；B5，ααα′；B6，ααα這6種異構體形式，基于這些結構，還可分為3組分別為A組（B1和B2）每個7S分子含有兩個β亞基，B組（B3和B4）含有一個β亞基，C組（B5和B6）不含β亞基，結構如圖1所示，也有研究表明可能還存在βββ的類型[24]。

圖1 β-伴大豆球蛋白及其六個異構體的亞基結構示意圖[23]Fig.1 Schematic representation of the subunit structure of β-conglycinin and its six isomers[23]

圖2 大豆蛋白晶體結構圖[26,28]Fig.2 The crystal structure of soy protein [26,28]

7S球蛋白亞基具有較高含量的天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和精氨酸。α和α′亞基富含酸性氨基酸殘基，在N-末端帶有纈氨酸，而β亞基則富含堿性氨基酸殘基（如賴氨酸和精氨酸）[10]，在N-末端帶有亮氨酸，因此賦予了不同的亞基結構性的差異[25]。Maruyama和Adachi[26-28]已經通過X射線晶體學描述出7S球蛋白的晶體結構圖，如圖2（a）所示為天然β-同源三聚體的帶狀模型，該同源三聚體的外徑均約為96 ?，單體的每個模塊細分為一個核心區域和一個環狀結構域，該環狀結構域包含多個α螺旋，從一對單體的任一側伸出，形成與其他亞基相互作用的鉤子。Utsumi和Maruyama發現該蛋白質主要由10%～15%的α-螺 旋，33%～39%的β-折 疊 和21%的β-轉角組成，并且蛋白質的三個亞基通過疏水相互作用力、氫鍵和果凍卷型結構的鹽橋結合在一起[26]。

每個11S球蛋白單體（300～380 kDa）由分子量約35 kDa的酸性亞基A（Acidic polypeptides，A）以及分子量約20 kDa的堿性亞基B（Basic polypeptides，B）在二硫鍵連接作用下組成[26]。有研究表明AB亞基通過靜電相互作用和氫鍵相互作用聯合形成兩個空心圓柱體的六邊形環[29-30]。Utsumi依靠11S球蛋白酸性亞基和堿性亞基的N-端氨基酸序列判斷出五個主要的亞基：A1aB1b、A2B1a、A1bB2、A3B4和A5A4B3。并根據它們的氨基酸序列將不同的大豆球蛋白分類為I組由三個亞基A1aB1b、A1bB2、A2B1a組成，IIa組由A5A4B3組成，IIb組由A3B4亞基[31-32]組成。Adachi等[33]已經通過X射線晶體學描述出11S球蛋白前原蛋白A1aB1b和A3B4的三維晶體結構圖，如圖2（b）（c）所示，其研究結果表明，A1aB1b前原蛋白由兩個類似果凍卷狀的三聚體疊放組成，該結構通過氫鍵和離子橋連接在一起，但是疏水相互作用在六聚體的形成中可能起主要作用。A3B4前原蛋白由兩個三聚體在鏈間二硫化物面上堆積成六聚體，并且還提出，存在移動的無序區域移至三聚體一側的現象，并將六聚體解離為三聚體，從而抑制六聚體的形成。

2 大豆蛋白的凝膠性

凝膠能力是大豆蛋白的最重要屬性之一，它賦予大豆蛋白較高的粘性、可塑性和彈性，在產品應用中既能做水的載體，也可做風味添加劑、糖及其他配合物的載體，這對食品加工極為有利[34]。其成膠方式很多，如熱誘導[35]、加鹽[36]、加酶等，均可使蛋白形成凝膠。凝膠性受多種因素的影響，例如：亞基組成、表面疏水性大小、巰基含量等，除此之外，蛋白質量濃度、加熱溫度、pH[37]、離子強度等[38]也是影響凝膠作用的重要元素。

2.1 7S球蛋白與11S球蛋白凝膠形成過程

由于大豆蛋白的復雜性，凝膠過程受眾種因素制約，所以人們對其凝膠化過程知之甚少，Nakamura[39-40]提出了11S球蛋白的凝膠化機理：在較短時間內加熱時（100 ℃加熱約15 s），六個蛋白分子組成短鏈，每個鏈均展開但仍保持球形（鏈I），鏈I通過與自身結合，形成較長的直鏈（鏈II），鏈II與其自身和或與鏈I結合形成支鏈和非支鏈（鏈III），然后鏈III形成凝膠網絡結構。其過程如圖3所示。Guo等[41-42]通過小角度X射線散射和動態光散射分析了兩種蛋白可溶和不可溶聚集體的結構，結果表明7S球蛋白可溶性的聚集體具有有限的尺寸和較不緊密的構象，11S球蛋白的不可溶聚集體具有較密的核心和較不致密的外殼顆粒，還表明，11S球蛋白的不溶性聚集體大小的增加會被7S球蛋白終止，可能是因為7S球蛋白與11S球蛋白的最不可溶的堿性多肽的互相作用[43]，這提高了它的溶解度。因此提出了7S球蛋白在大豆蛋白熱聚集中的作用如圖4所示。

圖3 大豆球蛋白凝膠化過程中可溶性聚集體的形成[39]Fig.3 Formation of soluble aggregates during the gelation of glycinin[39]

7S球蛋白和11S球蛋白在凝膠形成過程中相互作用機理，歸納總結如下：a.大豆蛋白溶液受熱使蛋白分子解離成α、α′、β、以及酸性亞基A和堿性亞基B；b.當蛋白溶液進一步加熱時，在解離的亞基中間因彼此互相作用形成了可溶性的肽鏈；c.在合適蛋白濃度下，β亞基與堿性亞基B相互作用產生沉淀，由α、α′亞基與酸性亞基A相互作用形成的寡聚體集中在上清液中。然而，7S球蛋白和11S球蛋白對凝膠網絡的形成，所做的貢獻是不同的[12,44]。通過差示掃描量熱法（Differential Scanning Calorimetry，DSC）分析，得到7S球蛋白的變性溫度為74 ℃，11S球蛋白的變性溫度為90 ℃[45]。有研究表明，單獨加熱兩組分時，發現7S球蛋白不會生成凝膠（濃度原因）或形成透明柔軟的凝膠[32,45]，而11S球蛋白則會形成堅硬和具有較高粘彈性的凝膠，這主要是因為在11S球蛋白凝膠形成的過程中產生較多的二硫鍵[41]。Nakamura等[46]研究發現保證7S球蛋白和11S球蛋白凝膠形成的最低蛋白濃度分別為7.5%與2.5%，而且隨著7S球蛋白的比例加大，大豆蛋白的凝膠硬度降低。因此，可以通過增加11S球蛋白的量或11S球蛋白與7S球蛋白的比例來增加凝膠的儲能模量，從而改善凝膠質量。并且有研究表明，在11S球蛋白較低濃度條件下，7S球蛋白對其熱聚集產生抑制作用[41,47]。Jacoba 等[45]研究了pH對大豆蛋白熱變性和凝膠形成特性的影響，結果表明，pH為7.6時，SPI凝膠體系中7S球蛋白的作用似乎不太重要，造成這種現象的原因可能是在7S球蛋白受熱變性開始時并沒有出現凝膠的大量形成，并且在加熱過程中，由11S球蛋白的酸性多肽和堿性多肽之間形成的二硫鍵被破壞了。綜上所述，大豆分離蛋白凝膠是一個極其復雜的系統，凝膠過程中受到眾多要素的影響，因此，在選用具有特殊蛋白組分的專用大豆品種進行蛋白質加工研究是今后發展的趨勢之一。

2.2 亞基組成對凝膠性的影響

亞基組成作為打開大豆蛋白構效關系的一把“鑰匙”，可以很好地解釋大豆蛋白的許多功能特性[48]。陳海敏等[49]研究品種差異對大豆蛋白功能性的影響，研究發現11S球蛋白含量越高，大豆蛋白凝膠特性越好，隨著7S/11S比例越大，凝膠的硬度和粘度越低。袁德保[50]對大豆蛋白熱聚集行為及其機理進行研究，探討了α、α′、β與堿性亞基組合體系的熱聚集行為，并提出了各亞基相互作用及機制，結果顯示，α、α′和β亞基都對蛋白的熱聚集反應起到抑制作用，但是α、α′亞基抑制效果強于β亞基。因此，研究大豆蛋白特定亞基與其功能特性關系是大豆蛋白加工的新領域。

圖4 在pH7.0下7S球蛋白和11S球蛋白的熱聚集行為的圖解描述[41-42]Fig.4 Diagrammatic depiction of thermal aggregation behavior of β-conglycinin and glycinin at pH 7.0 [41-42]

2.2.1α、α′對凝膠性的影響 因7S球蛋白的α′亞基（76 kDa）與α亞基（72 kDa）分子質量極其相似，研究者們多將其作為一個研究對象。在α′與α亞基對大豆蛋白的凝膠特性的影響研究中，表示出顯著相關。張國敏[51]研究亞基缺失對其蛋白質功能性評價中表明，蛋白凝膠硬度與α亞基含量呈負相關關系，與α′亞基含量呈正相關關系。Salleh等[52]探討了α及α′亞基缺失對大豆蛋白凝膠性的影響，表明在相同的試驗條件下，亞基組成對凝膠硬度的影響依次是α′亞基缺失、7S全亞基、α亞基缺失，并通過掃描電子顯微鏡結果推測形成的原因可能是當亞基缺失時，蛋白質部分厚度產生差異導致/引起形成的凝膠網狀結構密度有所不同。周宇鋒[53]對河南省16個大豆品種的亞基含量與豆腐的質構特征進行相關性分析，表明蛋白凝膠的硬度、彈性、黏聚性和回復性與α′亞基含量呈極顯著負相關，凝膠硬度與α亞基含量密切相關且呈現極顯著負相關。Wang等[54]根據豆腐質量評價模型推斷出α亞基、11S球蛋白等可預測豆腐的質量，為產生理想的大豆品種提供指導，以生產優質的食用豆腐。

2.2.2β亞基對凝膠性的影響 張國敏[51]的研究表明大豆分離蛋白凝膠硬度與7S球蛋白的β亞基含量呈負相關。王顯生等[55]卻表示蛋白凝膠硬度與β亞基呈正相關，這種差異的原因可能是試驗材料與實驗條件存在不同。周宇鋒[53]的研究表明7S球蛋白的β亞基含量與豆腐黏聚性指標呈極顯著正相關。孟巖[56]以缺少或缺失β亞基的大豆為原材料，探討了β亞基對大豆加工特性的影響，結果表明，當7S球蛋白中的β亞基含量增加時，豆腐的硬度、粘彈性等質構特性皆下降，針對不同品種SPI的功能特性進行檢測，研究結果表明，β亞基缺失的品種凝膠質構特性較差，因此，證明β亞基在大豆的加工過程中對蛋白質存在形態和凝膠空間網絡結構的形成起著極其重要的作用。

2.2.3 11S球蛋白組分對凝膠性的影響 11S球蛋白中的酸性亞基A和堿性亞基B對大豆蛋白凝膠特性有著重要的影響。對于豆漿而言，11S球蛋白I組（含A1，A2亞基）的樣品比不含I組的樣品含有更多的顆粒。在豆腐體系中，無論凝結劑如何，與IIa組相比，I組和IIb組（包含A3）形成了更堅硬的凝膠，而IIa（A4）亞基與豆腐的質量呈負相關[32,57]。Poysa[32]研究表示具有I組（A1，A2）亞基的大豆所產生的豆腐的質地特性比不含I組亞基的大豆制備的豆腐高約三分之一（以Harovinton′s值表示），還表示A1對GDL豆腐質量產生負面影響，A2產生正面影響。因此，11S球蛋白的亞基組成對豆腐的凝膠性起著重要的作用，這與石彥國[58]總結的結果保持一致。在大豆蛋白形成凝膠時，11S球蛋白的堿性亞基B與7S球蛋白的β亞基進行交互作用，11S球蛋白中的酸性亞基A和7S球蛋白中的α、α′亞基相互作用，對SPI的凝膠性起主要作用[59-60]。Fukushima等[61]的研究結果表明對大豆分離蛋白凝膠形成速率以及其透明度起主要作用的是A5A4B3亞基，而A3B4亞基與大豆蛋白凝膠的硬度有著密切的關系，A3亞基的缺失可能提高了凝膠硬度，這與豆腐體系結果有所不同，這個差異也表明對酸誘導和熱誘導凝膠的機理缺乏了解。張國敏[51]的研究表明大豆分離蛋白的凝膠硬度與酸性亞基A的含量呈現正相關關系，與堿性亞基B含量呈負相關。王顯生等[55]卻表示，蛋白的凝膠硬度與A3、B4兩個亞基均顯示正相關，與其他酸性亞基、堿性亞基呈負相關，這種差異的原因可能是試驗所用材料條件的不同。Bainy等[1]研究大豆11S球蛋白中亞基組成與大豆蛋白凝膠強度的關系，結果表明大豆蛋白的凝膠強度從大到小依次是：大豆蛋白、Ⅰ和Ⅱa亞基缺失型、Ⅰ和Ⅱb亞基缺失型、Ⅱa亞基缺失型、Ⅱa和Ⅱb亞基缺失型、Ⅰ亞基缺失型、Ⅱb亞基缺失型。此外，亞基組成的差異也會影響網絡結構，Bainy等[1]在蛋白質亞基組成對大豆分離蛋白的凝膠特性的的影響研究中表示11S球蛋白的A3亞基的存在阻礙了凝膠網狀結構的發展。

3 蛋白亞基缺失型的研究進展

隨著大豆蛋白亞基組成與其加工特性研究的不斷深入，研究者已經將重點逐漸轉移到通過育種方法改變蛋白亞基的組成，從而獲得某亞基缺失的大豆品種，使之成為特定加工特性的專用大豆原材料，為大豆產品的開發提供便利。在本方面的研究，國外的科學家走在前列，我國在亞基組成對大豆加工特性影響的報道較少，在大豆亞基缺失型品種的創新上也比較落后，但是發展的速度卻比較迅猛，并創制出具有中國遺傳背景的亞基缺失型大豆品系，為我國大豆產品開發提供重要的材料。表1是國內外關于亞基缺失型大豆品種的研究進展。

為了驗證亞基缺失對大豆蛋白加工特性的影響，國內外的專家也做了很多研究。Salleh等[52]研究表明因亞基缺失導致蛋白凝膠硬度產生差異。Kawamura[70]為了闡明大豆蛋白中11S球蛋白的酸性亞基A5對凝膠特性的影響，通過動態粘彈性測量研究了豆漿的凝膠化過程，發現A5亞基缺失品種制備的豆腐凝膠更堅硬。Tosh[1]表明缺少A3亞基和11S組分的A1、A2和A4亞基的組合可能形成了較硬的凝膠結構。Amir[71]表示當大豆中不含大豆球蛋白或缺乏大豆球蛋白的I組（A1，A2）時，豆漿顯示出較小的粒度分布，并且加熱后，IIa和IIb組的溶液比I組溶液具有更多的顆粒蛋白質。劉春等[55]以A3B4亞基缺失、A1aA1b亞基缺失、A5A4B3亞基缺失、M11SR（11S含量極低）的SPI和南農大黃豆粗7S蛋白為原料，對大豆蛋白功能特征進行評價，結果表明：11S球蛋白中單個亞基缺失對蛋白乳化特性和乳化穩定性無顯著影響，11S球蛋白的含量減少或缺失顯著提高大豆分離蛋白的乳化特性和乳化穩定性，同時凝膠特性測定結果表明，7S球蛋白含量與大豆分離蛋白凝膠粘彈性呈顯著正相關，11S球蛋白含量則與蛋白凝膠粘彈性之間呈現極顯著負相關，與蛋白凝膠硬度和破裂強度之間呈顯著正相關。Li等[72]表示SPI的亞基變化，尤其是11S球蛋白亞基含量的下降，可以較好地反映SPI的預熱誘導凝膠變性程度。綜上所述，不同亞基構成對凝膠特性的影響是不盡相同的，因11S球蛋白的亞基組成比7S球蛋白復雜，所以需要更系統的研究其凝膠體系的形成機理，從而剖析亞基在凝膠形成過程中的作用機制。因此，明確單個亞基對加工特性的貢獻，對大豆蛋白產品的生產及應用有更重要的意義。

改變大豆蛋白的亞基組成不僅可以影響其加工特性，還可以直接影響其營養特性。拓云等[73]對兩個致敏蛋白α亞基缺失型大豆分離蛋白氨基酸的營養價值進行評價，探討α亞基缺失型大豆的氨基酸組成特征以及其營養指標，結果表明，當α亞基缺失時，其氨基酸總量（TAA）、必需氨基酸總量(TEAA)、蛋白質、脂肪含量未發生變化，另外，其必需氨基酸含量接近或高于FAO/WHO標準，證明了α亞基缺失時大豆蛋白氨基酸組成平衡，11S/7S比值更優，營養品質更高。國博聞等[74]對具有中國大豆遺傳背景的7S球蛋白與11S球蛋白多亞基缺失型大豆新品系進行氨基酸組成分析，結果表明，當7S球蛋白與11S球蛋白多個亞基缺失時，既可以有效的去除致敏蛋白，也可以改善其氨基酸的組成及特征，優化氨基酸之間的最優比。因此，選擇特定的大豆品種進行加工，既可以改善產品質量，也可以提高其營養價值。

雖然亞基組成直接影響大豆蛋白的加工特性與營養特性，但是其具體作用機理還不是很明確。因此，從大豆蛋白亞基組成的方向分析其功能特性，對我國豐碩的大豆品種資源開發，確立專用特性、專用品種的加工研發具有深遠的意義。

表1 亞基缺失型大豆品種Table 1 Subunit- deficiency soybean varieties

4 前景與展望

大豆蛋白雖然是最重要的植物蛋白，但是其結構復雜，各個組分分別決定著不同的特性，因此，基于結構與性質的關系，大豆蛋白亞基缺失型的特性研究成為目前的一個研究熱點。亞基組成在一定程度上影響豆制品的加工特性、品質與應用范圍，因此，掌握亞基組成對加工特性的影響機理，有利于實現國家大豆產業技術體系“專一產品，專用品種”的行業趨勢。近年來，開展這項工作的主要是日本和加拿大的研究者，其研究熱點主要集中在合適豆腐加工的特殊品種和11S球蛋白亞基缺失類型品種的加工特性上，其研究體系以單組分為主，故需要確立在混合體系中亞基組成對其影響。另外，國內外多數研究主要集中在乳化性和凝膠性上，對其他加工特性如溶解性、起泡性等的研究并未完善，所以其他加工特性的研究還需更深更廣的展開。而亞基組成對酶制凝膠和冷凝膠的影響尚未明確，仍需進一步探討研究。因此，有目的性的選用具有特殊蛋白亞基或組分的專用大豆品種進行蛋白質加工研究，可以為大豆蛋白產品的開發和應用提供重要的理論指導。