瘦素受體敲除引起大鼠腦組織小膠質細胞活化

丁登峰,高 翔,張 旭,劉 旭,孫彩顯,張 麗,張連峰,*

(1.北京協和醫學院比較醫學中心,中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室, 北京 100021. 2.北京協和醫學院比較醫學中心,中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心, 北京 100021)

瘦素受體(leptin receptor, LEPR) 是瘦素(leptin) 的功能性受體,Leptin/LEPR 軸能激活JAK2-STAT3、PI3K 和 AMPK 等信號轉導通路,從而發揮抑制食欲、促進能量消耗,減少脂肪含量調節體重的功能[1-3]。 LEPR 的突變是嚙齒類動物和人類肥胖/糖尿病突變的基礎[4]。 LEPR 缺失的db/db小鼠(diabetes mouse),是典型的2 型糖尿病模型,能夠反映肥胖、糖耐量進行性惡化、高血壓和高脂血癥等人類疾病的表型[5-6]。 LEPR 的突變的大鼠(zucker diabetic fatty rats, ZDF)也表現高胰島素血癥、高脂血癥和高血壓,并表現出糖耐量減低的2 型糖尿病癥狀[7-8]。 瘦素受體敲除大鼠表現為過度肥胖、多飲、多食、血糖高、對葡萄糖不耐受、高胰島素血癥和血脂異常[9-10]。

Leptin/LEPR 軸不僅與能量代謝有關,Leptin 和LEPR 在被發現腦中具有表達[11]。 那么,Leptin/LEPR 是否參與腦中免疫調節的問題,目前研究很少。 已知無論是在leptin 突變的 ob/ob 和 LEPR 突變的 db/db 小鼠,都有明顯的腦損傷和神經炎癥[12-13]。 小膠質細胞(microglia)是中樞神經系統的主要免疫細胞,與腦損傷與神經炎癥有關[14-15],但目前瘦素受體與小膠質細胞、神經炎癥的研究報道的很少,這將是本文的切入點,利用瘦素受體敲除大鼠闡述LEPR 與小膠質細胞之間的聯系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

LEPR 全身敲除大鼠(LEPR-/-)由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所遺傳疾病模型工程平臺培育,LEPR-/-繁育過程中所需的8 周齡SPF 級SD大鼠由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供[SCXK(京)2019-0011]。 雌雄各 10 只,體重在200～400 g 之間,按照雌雄比例 1 ∶1進行合籠繁育。 實驗所需大鼠均飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所屏障環境動物房[SYXK(京)2019-0014],飼養間溫度(23±2)℃,12/12 h 明暗交替照明,動物自由飲水及采食。 本實驗涉及到的所有實驗動物程序均通過中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC ZLF18003)的批準,實驗過程中遵循了3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 培養基、Neurobasal Media 神經元培養基、DPBS 緩沖液和Fetal Bovine Serum 胎牛血清購自于美國 Gibco 公司;FITC-Dextran 購自美國Sigma 公司;Aβ(1-40)購自于美國 AnaSpec 公司;TRIzol 購自于美國賽默飛公司;一抗leptin receptor、PI3K 和 AKT 購自于英國 Abcam 公司;RT-PCR 試劑盒購自于日本TaKaRa 公司;無水乙醇和異丙醇購自于北京化工廠有限責任公司;DNA 提取試劑盒和質粒小提試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;兔二步免疫組化試劑盒和DAB 染色液購自于北京中杉金橋生物技術有限公司;細胞培養板和細胞培養瓶購自于美國康寧公司;實時熒光定量PCR儀購自美國伯樂公司;激光共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡購自于德國萊卡公司;離心機和移液器購自于德國艾本德公司;6 孔板、24 孔板細胞爬片和10%福爾馬林固定液購自于北京索萊寶科技有限公司;qPCR 引物購自于北京天一輝遠生物科技有限公司; 生物安全工作臺購自于蘇州設備凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠原代神經元細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞培養

LEPR+/-交配,選取同窩陰性對照(LEPR+/+)和敲除純和子(LEPR-/-) 1 周齡新生 SD 幼鼠各20只,低溫麻醉處死,用高壓過的手術器械取出大腦置于含DPBS(Gbico)的圓皿中清洗,去除腦組織上面的腦膜和血塊,然后在1 mL 胰酶中剪碎,再加入2 mL 胰酶轉移到15 mL 離心管置于溫箱中消化8 min,加10 mL 培養基混勻中和胰酶消化,將上清過濾到新的 15 mL 離心管中,1500 r/min,離心5 min,倒掉上清,保留管底沉淀,用1 mL 培養基吹打混勻后轉移至75 cm2培養瓶中[16]。 將獲得的細胞放在在含5% CO2, 37℃的細胞培養箱里常規培養7～14 d左右。 上述是三種細胞的共同培養步驟,但是培養基和分離方式不同,其中原代星形膠質細胞和小膠質細胞的培養基是含10%胎牛血清,1%非必需氨基酸,1%青霉素/鏈霉素和1%的谷氨酰胺的DMEM-F12 培養基(Gbico),上層細胞是小膠質細胞,37℃搖床,200 r/min 振蕩分離2 h 即可獲得,下層貼壁細胞是星形膠質細胞,用胰酶消化即可獲得;原代神經元細胞的培養基是含有10% B27,1%非必需氨基酸,0.5%青霉素/鏈霉素和1%的谷氨酰胺的Neurobasal Media 無血清培養基(Gbico),其他細胞在此環境中無法存活,獲得的細胞即為神經元細胞。

1.3.2 小膠質細胞吞噬的免疫熒光觀察

在24 孔板中放置多聚賴氨酸包被過的爬片(Acmec),接種原代小膠質細胞,接種密度一般為60%～70%,完全培養基培養24 h, 隨后換無血清培養液饑餓培養12 h,隨后分別給予吞噬示蹤劑FITC-Dextran(Sigma)和 Aβ(1-40)(AnaSpec),分別繼續孵育 2 h 和 3 h,暗光處 PBS 洗 3 次,每次 3 min,4%多聚甲醛(碧云天)固定20 min,PBS 洗3次,每次3 min,DAPI(中杉金橋)封片,雙光子顯微鏡(Leica)觀察小膠質細胞吞噬。 每組30 個視野,根據小膠質細胞吞噬的熒光強度用Image J 軟件計算每個小膠質細胞吞噬能力。

1.3.3 LPS 誘導致死性和腦組織小膠質細胞形態分析

選取8 周齡 LEPR+/+和 LEPR-/-大鼠,分為 4組,每組12 只大鼠,雌雄各6 只,雄性大鼠體重在200～450 g 之間,雌性大鼠體重在 200 ～350 g 之間,各個組分別為LEPR+/+組,LEPR-/-組,LEPR+/++LPS組,LEPR-/-+LPS 組。 LEPR+/+組和 LEPR-/-組腹腔注射0.2 mL PBS;LEPR+/++LPS 組和LEPR-/-+LPS組,根據體重分別腹腔注射LPS(Sigma),注射劑量為0.5 mg/100 g。 隨后每1 h 觀察大鼠情況,LPS 處理的大鼠瀕臨死亡時麻醉取材,PBS 組大鼠同時間點取材。 48 h 未死大鼠安樂死取材。 統計LPS 誘導致死的數量,并作生存曲線。 大腦組織福爾摩林固定,按一般病理程序石蠟包埋,制備 5 μm 切片[17],用 1 ∶100 稀釋的抗 IBA-1 單克隆抗體(Abcam)標記腦組織的小膠質細胞,用兔二步法免疫組化試劑盒標記二抗,DAB 顯色(中杉金橋),Pannoramic 掃描儀掃描(3DHISTECH),觀察并統計小膠質細胞的不同活化形態。

1.3.4 蛋白提取與蛋白免疫印跡

收集LEPR+/+和LEPR-/-大鼠原代小膠質細胞,在細胞蛋白裂解液Pierce TM RIPA Buffer 中,加入1%PMSF,1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑(Thermo),冰上裂解 20 min。 4℃,10000 r/min 離心10 min。 用BCA 法測定蛋白濃度。 將蛋白樣品按照等質量上樣于10%的SDS-PAGE 電泳,冰水混合物中恒流濕轉,5%封閉液(脫脂奶粉配置)室溫封閉 1 ～ 2 h。 一抗 leptin receptor(5%BSA,1 ∶1000,Abcam)、PI3K(1 ∶1000,CST)、 p-PI3K(1 ∶1000,CST)、AKT(1 ∶1000, CST)、p-AKT(1 ∶1000, CST)。4℃孵育過夜。 TBST 洗膜 3 次,每次 10 min。 兔抗山羊IgG 二抗(1 ∶10000,CST)搖床低速振蕩,室溫孵育1 h,TBST 洗膜3 次,每次10 min,化學發光試劑盒進行曝光顯影。

1.3.5 細胞RNA 提取和實時熒光定量PCR

收集LEPR+/+和LEPR-/-大鼠原代小膠質細胞,TRIzol 法(Thermo)提取 RNA,取1μg RNA 按照試劑盒方法(Takara)進行逆轉錄反應獲取cDNA,RTPCR 檢測 leptin receptor 以及 IL-6, i-NOS,IL1-β 等的表達。 以GAPDH 基因作為內參,定量分析。 引物序列見表1。

1.4 統計學方法

所有獨立實驗重復3 次,用Image J 軟件計算蛋白免疫印跡條帶灰度值和免疫熒光熒光值,采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行柱形圖繪制和統計學分析,數據以平均數±標準差()表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,P＜0.05 為差異有統計學意義,多組數據采用方差分析F檢驗,并得到F值。

2 結果

2.1 LEPR 的表達、敲除效率及 LEPR-/-大鼠對LPS 刺激不耐受

為了確定LEPR 在腦中表達的細胞類型,分離并培養大鼠原代小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元,用RT-PCR 分析LEPR 的表達,結果表明,LEPR在小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元中均有表達(圖1A)。 分離 LEPR 基因敲除大鼠 LEPR-/-的原代小膠質細胞,Western blot 分析證實,LEPR 蛋白表達被完全剔除(圖 1B)。 對比分析 LEPR+/+和LEPR-/-大鼠對LPS 刺激的反應性,表明LEPR 敲除增加了大鼠LPS 刺激的敏感性,LEPR-/-大鼠在LPS刺激下48 h 內生存率降低了75%。 (圖1C、1D)

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2 小膠質細胞形態結構的變化情況

用小膠質細胞的標志分子Iba1 的抗體,比較分析LEPR+/+和LEPR-/-大鼠大腦組化中小膠質細胞的形態 (圖2A、2C),相比于LEPR+/+,LEPR-/-腦組織中處于靜息態(Resting)的小膠質細胞減少了55.2%(n= 6,P＜0.001), 而趨于活化的肥大態(Hypertrophic)和阿米巴樣態(Amoeboid)的小膠質細胞分別增加了34.7%和14.1%(n=6,P＜0.01)。LEPR-/-大鼠對 LPS 刺激反應更強烈,相對于LEPR+/+(LPS), LEPR-/-(LPS)大鼠腦組織中處于靜息態的小膠質細胞減少了 16.1%(n= 6,P＜0.01), 而趨于活化的肥大態和阿米巴樣態的小膠質細胞分別增加了 16.6%和 25.1%(n= 6,P＜0.01)。 (圖2B、2D)統計各種小膠質細胞形態的數目作圖(圖2E)。

2.3 LEPR 敲除大鼠小膠質細胞炎性因子分泌增加

為了進一步明確LEPR-/-對小膠質細胞的活化作用,分別分離了來源于LEPR+/+和LEPR-/-大鼠的原代小膠質細胞,用RT-PCR 對比分析了3 種炎性因子的mRNA 表達水平(圖3A ～3C)。 不存在刺激因素的情況下,與LEPR+/+相比LEPR 敲除導致IL-6, i-NOS,IL-1β 表達分別增多了 61.4 倍,53.7 倍和2.7 倍。 在LPS 刺激的情況下,LEPR 敲除導致 IL-6, i-NOS,IL-1β 表達分別增多了 3.3 倍,1.8 倍和1.9 倍,同時在A-C 三個多組數據中得到的F值分別是94.47,86.95 和33.64。 見圖 3D、3F,我們進一步對LEPR+/+小膠質細胞進行瘦素蛋白處理,反向驗證了LEPR 的激活可以抑制炎性因子表達,證明敲除LEPR 會增強炎性因子表達。

圖1 LEPR 的表達、敲除效率及LEPR-/-大鼠對LPS 刺激不耐受Note. A, LEPR expression in microglia, astrocytes and neurons. B, The expression of LEPR gene in microglia of LEPR-/-was completely silenced. C/D, LEPR+/+ and LEPR-/-rat responses to LPS treatment and corresponding survival curves.Pairwise comparisons of the three groups of cells, *P＜0.05.Figure 1 Expression and knockout efficiency of LEPR and LEPR-/- rat tolerance to LPS treatment

圖2 小膠質細胞形態結構的變化情況Note. A/C, LEPR+/+ and LEPR-/- microglia morphology in rat brain slices. B/D,Morphology of microglia in brain slices,LEPR+/+(LPS) and LEPR-/-(LPS) rats. E, Microglia count.Compared with LEPR+/+rats and LEPR+/+(LPS) rats, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 2 Changes of microglia cell morphology and structure

圖3 LEPR 敲除大鼠小膠質細胞炎性因子分泌增加Note. A～C,Expression of IL-6,i-NOS,IL-1β in the presence or absence of LPS stimulation. D-F,IL-6,i-NOS,IL-1β expression of in response to leptin.Compared with LEPR+/+rats and LEPR+/+(LPS) rats,*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 3 Increased secretion of inflammatory factors in microglia cells of LEPR knockout rats

2.4 LEPR 敲除大鼠小膠質細胞吞噬能力增強

小膠質細胞的活化一般會伴隨著吞噬能力的增強,分離LEPR+/+和LEPR-/-原代小膠質細胞,對比分析其對Dextran 的吞噬(圖 4A、4B)和 Aβ 的吞噬(圖4C、4D),結果表明,相比于LEPR+/+小膠質細胞,LEPR-/-小膠質細胞Dextran 和Aβ 的吞噬分別增加了 10.3 倍和 6.5 倍(P＜0.05)。

2.5 PI3K/AKT 信號通路可能參與小膠質細胞促炎促吞噬過程

分離 LEPR+/+和 LEPR-/-大鼠的腦組織,用Western blot 分析 JAK2、STAT3、PI3K、AKT、ERK1/2等信號分子的磷酸化(圖5A ～C)。 LEPR 敲除沒有明顯改變JAK2、STAT3和ERK1/ 2的磷酸化水平(結果未見)。 LEPR 敲除反而激活了PI3K/AKT 通路LEPR-/-腦組織蛋白中PI3K 和AKT 的磷酸化分別增加了 2.9 倍和 1.6 倍(P＜0.05)。

圖4 LEPR 敲除大鼠小膠質細胞吞噬能力增強Note. A/B, Dextran phagocytosis. C/D, Aβ phagocytosis.Compared with LEPR+/+rats, *P＜0.05.Figure 4 Enhanced phagocytosis of microglia cells in rats with LEPR knockout

圖5 PI3K/AKT 信號通路可能參與小膠質細胞促炎促吞噬過程Note. A, PI3K/AKT pathway. B, p-PI3K gray value. C, p-AKT gray value.Compared with LEPR+/+rats, *P＜0.05.Figure 5 PI3K/AKT signaling pathway may be involved in the proinflammatory and phagocytic process of microglia cells

3 討論

瘦素主要由脂肪組織分泌,與瘦素受體結合,除了調節能量代謝,還能作為炎性因子激活巨噬細胞,參與外周神經性疼痛[18-20]。 表達在巨噬細胞中的瘦素受體維持著其吞噬,清除的能力,影響炎性因子的分泌,并被證實瘦素受體可單獨影響巨噬細胞不受其他因素干擾[21-22]。 小膠質細胞認為是腦組織中特化的巨噬細胞[14],但關于瘦素受體與小膠質細胞的報道卻很少。 小膠質細胞不管是本身的生物學特性,還是微環境與巨噬細胞有一定的差別,對巨噬細胞的研究結論不能簡單的推理至小膠質細胞。 本研究通過 LEPR 敲除大鼠明確了在LEPR 缺失的情況下,小膠質細胞會由靜息狀態轉化為肥大形態和阿米巴樣形態,并表現出促炎和促吞噬的表型。 推測Leptin/LEPR 在小膠質細胞中,應該是抗炎的,而不是巨噬細胞中的促炎作用。

LEPR 基因敲除導致小膠質細胞活化主要表現在三個方面:第一、LEPR-/-大鼠的腦組織中小膠質細胞由靜息形態向肥大形態和阿米巴樣形態轉換,表現為胞體變大(圖2)。 小膠質細胞的增生與肥大被認為是M1 型的極化,通常與炎癥有關[23-25],阿米巴樣形態的小膠質細胞更傾向于吞噬[26-28]。 第二、LEPR-/-小膠質細胞比LEPR+/+小膠質細胞表達更多的 IL-6,i-NOS 和 IL-1β 等炎性因子(圖 3)。 小膠質細胞分泌IL-6 增多,通常認為與腦損傷,自閉癥和多動癥有關[29-30];IL-1β 和i-NOS 升高與神經炎癥有關[31-32],在給予 LPS 刺激后,LEPR+/+組和LEPR-/-組的 IL-6,i-NOS 和 IL-1β 表達均升高,并且LEPR-/-組炎性因子升高更為明顯,我們發現LEPR敲除后發生的內質網應激參與了炎癥[10],提示內質網應激可能在LEPR-/-組在LPS 刺激后炎性因子明顯升高中發揮作用;此外我們也做了腫瘤壞死因子TNF-α 的表達,發現 LEPR-/-組 TNF-α 的表達存在爭議,這與我們預期不符(結果未顯示),猜測LEPR的敲除會降低磷酸酶D1 的表達從而抑制了TNF-α的表達;第三、LEPR-/-小膠質細胞比LEPR+/+小膠質細胞表現出更強的吞噬Aβ 和Dextran 的能力(圖4),這與小膠質細胞由靜息形態向阿米巴樣形態轉變結果相符合。 無論是在 leptin 突變的 ob/ob 和LEPR 突變的db/db 小鼠,都有明顯的腦損傷和神經炎癥[12-13], 結合我們的研究結果,ob/ob 和db/db小鼠的神經炎癥不僅僅是肥胖和2 型糖尿病引起的,一部分原因應該是leptin 和LEPR 的功能缺失引起的小膠質細胞活化。 我們對比分析了幾種可能參與小膠質細胞活化的信號通路,發現LEPR 敲除沒有明顯改變JAK2、STAT3 和ERK1/2 的磷酸化水平,反而是激活了PI3K/AKT 通路(圖5),有報道認為,PI3K/AKT 激活,能調節 IL-6,i-NOS,IL-1β,TNF-α 等炎性因子的表達[33-34],我們的結果未能解釋LEPR 敲除如何激活了PI3K/AKT 通路,但是該通路的激活可能是小膠質細胞活化的信號通路之一。

綜上所述,本研究在瘦素受體敲除的大鼠模型中發現小膠質細胞向著促炎促吞噬的表型轉變,首次將瘦素受體與小膠質細胞和神經炎癥聯系起來,并揭示了LEPR/Leptin 可能通過小膠質細胞調節神經炎癥,并可能在中樞神經系統里面發揮著某種保護性作用。