小鼠出生后早期心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量及性狀變化研究

劉維靜,聶 宇,廉 虹*,王玉瑤*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,太原 030001; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國(guó)家心血管病中心阜外醫(yī)院心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100037)

心血管疾病(心肌梗死、心衰等)最終的結(jié)局均會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞的丟失,大量研究表明,成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞處于終末期分化狀態(tài)而不能通過(guò)有絲分裂進(jìn)行增殖,再生能力非常有限[1-2]。 因此,心肌再生的機(jī)制研究一直是心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 小鼠是心血管疾病領(lǐng)域研究中使用最為廣泛的哺乳動(dòng)物模型之一[3]。 2011 年,Porrello 課題組在新生小鼠出生后第1 天切除約15%的心尖部分,21 天后心臟可以完全再生,但在出生后第7 天進(jìn)行心尖切除后心臟卻失去再生能力,只能出現(xiàn)疤痕修復(fù)[4]。 1 d 和7 d 心臟組織再生能力改變的原因一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[5-7]。 心臟成纖維細(xì)胞占整個(gè)心臟組織的50%以上,在心臟中起到分泌膠原和生長(zhǎng)因子等作用,是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的一類重要細(xì)胞類型,在維持心臟結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用[8]。 近年研究表明,心臟成纖維細(xì)胞在心肌再生領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用[9-11]。 本文通過(guò)比較小鼠出生后1 d 和7 d 的心臟組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量的變化以及對(duì)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的分析,探究了小鼠出生1 d 和7 d 心肌成纖維細(xì)胞的比例和性狀變化,為研究心肌成纖維細(xì)胞在再生領(lǐng)域的研究提供基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80 只出生 1 d(1.2 ～1.5 g,誤差小于 10%)和60 只出生7 d(4.5 ～4.8 g,誤差小于 10%)的 SPF級(jí)別C57BL/6 J 小鼠購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],不區(qū)分雌雄。 小鼠的模型制作以及取材均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院國(guó)家心血管病中心E 座屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(京)2017-0015]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及的動(dòng)物所有操作程序符合3R 原則,已得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)(FW-2019-0005)。

1.2 主要試劑與儀器

BD Aria II 流式細(xì)胞儀(FACSAria 2,美國(guó));體式顯微鏡(Zeiss,德國(guó));全自動(dòng)組織脫水機(jī)(Leica,德國(guó));展片機(jī)(Leica,德國(guó));烤片機(jī)(Leica,德國(guó));熒光共聚焦顯微鏡(Zeiss,德國(guó));全自動(dòng)掃片機(jī)(Zeiss,德國(guó));普通 PCR 儀(Bio-Rad,美國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad,美國(guó));DMEM(Gibco,美國(guó));胎牛血清(Gibco,美國(guó));含 EDTA 的胰酶(Gibco,美國(guó));Masson 染色試劑盒(Sigma);antisarcomeric alpha actinin (1 ∶200,ab9465,Abcam,英國(guó)),anti-Vimentin (1 ∶100,ab92547,Abcam,英國(guó));Neonatal Heart Dissociation Kit(Miltenyi 公司, 德國(guó));Gentle MACS Octo Dissociator 儀器(Miltenyi 公司,德國(guó));Neonatal Cardiac Fibroblast Isolation Kit(Miltenyi 公 司, 德 國(guó));SYBR Green qPCR Master Mix(A25742,美國(guó) Applied Biosystems)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 流式細(xì)胞分選

流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選,檢測(cè)懸浮在液體中的單個(gè)分散細(xì)胞以及其它微粒信號(hào),一般先將待測(cè)樣本熒光染色后制備為懸液標(biāo)本,在周圍氣體壓力下待測(cè)樣本流入流動(dòng)室,鞘液從鞘液管中流出,包裹著待測(cè)樣本高速流動(dòng),形成鞘流,待測(cè)細(xì)胞分開(kāi)為單個(gè)細(xì)胞依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域,達(dá)到細(xì)胞分選的目的[12]。

(1)樣本制備

①小鼠心臟的獲取

出生1 d 的小鼠40 只,出生7 d 的小鼠20 只,使用75%乙醇對(duì)小鼠進(jìn)行消毒,快速取出心臟,剪掉連帶血管組織,PBS 沖洗3 次,將心臟中血液沖洗干凈備用,此過(guò)程在冰上操作。

②剪碎,消化心臟組織,收集細(xì)胞

將取出的心臟組織置于10 cm 直徑的培養(yǎng)皿中,剪碎至大約每小塊1 mm3,置于帶有自制轉(zhuǎn)子的三角燒瓶中,加入10 mL 0.08%的胰酶的消化液,放入磁力攪拌的水浴鍋中,調(diào)節(jié)溫度30℃,消化 8 min,棄掉上清(首次消化除去血細(xì)胞)。 繼續(xù)加入10 mL 0.08%的胰酶進(jìn)行消化8 min,吸取上清經(jīng)40 μm 的篩子過(guò)濾后,置于 10 mL 含 10% FBS 的DMEM 中,此過(guò)程重復(fù)操作7 ～8 次后,組織塊成絮狀,說(shuō)明細(xì)胞基本無(wú)殘留,終止消化過(guò)程,將收集到的細(xì)胞懸液,室溫 1200 r/min,5 min 離心,收集細(xì)胞。

(2)細(xì)胞分選

①制備上機(jī)懸液

將收集好的細(xì)胞使用PBS 沖洗一次,1×106細(xì)胞量為一個(gè)反應(yīng),成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志物Thy1-APC抗體以1 ∶100 的比例稀釋,同時(shí)做好陰性對(duì)照和同型對(duì)照(Isotype control)。 混勻后冰浴 30 min,后1200 r/min,5 min 離心,棄上清,再次使用PBS 清洗一次,最后40 μm 細(xì)胞過(guò)濾篩子過(guò)濾至流式管中,待上機(jī)。

②流式上機(jī)分選

細(xì)胞懸液上機(jī)前5 min 加入活性染料7-AAD,混勻,上機(jī),收集分選后的心肌成纖維細(xì)胞,分選結(jié)束后,將分選出的陽(yáng)性細(xì)胞管進(jìn)行回測(cè)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證細(xì)胞純度。 所有流式細(xì)胞術(shù)均在BD Aria II 流式細(xì)胞儀上進(jìn)行,分選目的細(xì)胞的電壓分別為,FSC: 100 V, SSC: 250 V, APC: 181 V。

1.3.2 心尖切除

出生1 d 和7 d 的小鼠分別埋于碎冰中冰凍麻醉2 min 和5 min,醫(yī)用膠帶將小鼠四肢固定在預(yù)冷的微型金屬手術(shù)臺(tái)上,將其置于體式顯微鏡下,75%乙醇對(duì)小鼠胸前皮膚進(jìn)行消毒。 用顯微剪于小鼠第4～5 肋間隙剪開(kāi)長(zhǎng)約1 cm 的切口,隨后利用眼科鑷撐開(kāi)胸腔,輕輕撕掉心包膜,采用顯微鑷在切口外端輕微按壓擠出心臟,之后使用虹膜剪剪去心臟部分左心室心肌組織,左心室輕微滲血即可,隨后將心臟送回胸腔。 8-0 滌綸線縫合小鼠皮膚后,將小鼠置于37℃恒溫臺(tái)數(shù)分鐘,待小鼠完全恢復(fù)呼吸、活動(dòng)自由后放回母鼠籠中。

1.3.3 組織學(xué)檢測(cè)

對(duì)出生1 d 和7 d 的小鼠分別進(jìn)行心尖切除(AR, Apical resection),術(shù)后21 d 取完整心臟,4%多聚甲醛固定48 h,脫水后進(jìn)行石蠟包埋,以5 μm的厚度切片。 按照之前研究操作[13],將石蠟切片放在烤片機(jī)上68℃烘烤45 min 防止脫片,隨后將玻片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min,100%、95%、80%、75%、50%梯度乙醇中各5 min 進(jìn)行脫蠟、水化,之后在重鉻酸鉀中過(guò)夜,使用Masson 染色試劑盒進(jìn)行染色,根據(jù)Masson 染色方法,苯胺藍(lán)染液將膠原纖維染為藍(lán)色即為組織纖維化。 若心尖處無(wú)藍(lán)色纖維化組織則可視作心臟完全再生,若心尖處存在纖維化組織則為心臟不完全再生,再生率是指術(shù)后完全再生小鼠只數(shù)占所有手術(shù)小鼠只數(shù)百之比。 對(duì)于HE 染色,則需將玻片在烤片機(jī)上68℃烘烤45 min后直接進(jìn)行染色。

1.3.4 免疫熒光染色

取1 d 和7 d 小鼠完整心臟,4%多聚甲醛固定24 h,脫水后進(jìn)行石蠟包埋,以5 μm 的厚度切片。根據(jù)之前研究[13],脫蠟水化之后使用EDTA 修復(fù)法高溫修復(fù)2 min,使用含Triton-X 100 的山羊血清封閉液封閉1 h,在4℃孵育一抗過(guò)夜:anti-sarcomeric alpha actinin (1 ∶200; ab9465, Abcam, UK),anti-Vimentin (1 ∶100; ab92547, Abcam, UK)。 室溫復(fù)溫1 h,使用PBS 將玻片洗滌5 次,每次5 min,在室溫與熒光標(biāo)記二抗避光孵育1 h,PBS 洗滌玻片5次,每次5 min,然后使用含DAPI 的封片劑封片。我們使用蔡司LSM800 共聚焦激光掃描顯微鏡(Carl Zeiss, Inc., Jena, Germany)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.3.5 心臟組織成纖維細(xì)胞分離

取1 d 和7 d 小鼠完整心臟各20 只,剪掉血管連帶組織,在PBS 緩沖液中沖洗3 遍,放入含有酶液(含酶 A:12.5 μL、酶 P:62.5 μL、酶 D: 100 μL、緩沖液 Y:25 μL、緩沖液 X:2300 μL)的 C 管中,利用Neonatal Heart Dissociation Kit 及 Gentle MACS Octo Dissociator 儀器消化心臟;消化結(jié)束后立即用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM 終止消化,70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾,1000 r/min 離心5 min,棄上清,使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,3 min 后使用PBS 緩沖液終止裂解,1000 r/min 離心5 min;使用含有穩(wěn)定劑和0.05%疊氮化鈉的緩沖液重懸,30 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾,使用Count Star 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按照5×106細(xì)胞量為一個(gè)體系,使用Neonatal Cardiac Fibroblast Isolation Kit 分離成纖維細(xì)胞。

1.3.6 qRT-PCR

使用TRIzol 試劑(Invitrogen)提取分離的心臟成纖維細(xì)胞中的 RNA,然后使用 PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa,RR036A)將其轉(zhuǎn)化為 cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix 進(jìn)行qRT-PCR,并在Vii7 Real-Time PCR System 上擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min,后95℃運(yùn)行15 s 進(jìn)行變性,60℃運(yùn)行15 s 進(jìn)行退火,72℃運(yùn)行1 min 進(jìn)行延伸,變性、退火、延伸過(guò)程共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。 下面列出了 該 反 應(yīng) 的 所 有 引 物。Thy1 正 向: 5′-GGAACTCTTGGCACCATGAAC-3′, 反 向: 5′-TTATTCTCATGGCGGCAGTC-3′;Fsp-1 正 向: 5′-GGAGGCCCTGGATGTAATTGTG - 3′, 反 向: 5′-CAACTTCATTGTCCCTGTTGCTG-3′;Periostin正向:5′-ACTGAATGCCTTACACAGCCACA-3′, 反 向:5′-TCGAGCACAGTTCACAGTGACAA-3′;Pdgfα正向:5′-GGCAGGCACATTTACATCTATG - 3′, 反 向: 5′-CATCCTCTTCCACGATGACTAA-3′;Col1a1 正向:5′-TGAACGTGGTGTACAAGGTC-3′, 反 向: 5′-CCATCTTTACCAGGAGAACCAT-3′;Tcf21 正 向:5′-GCGATGTAGAAGACCTTCAAGA - 3′, 反 向: 5′-GAAGTTCCAAACTCCTTGTTGG-3′;Gapdh正向:5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGAATTG - 3′, 反 向: 5′-AGAGATGATGACCCTTTTGGCTCC-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 GraphPad Prism(7.0 版,GraphPad 軟件)分析所有結(jié)果。 所有數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()。 組間差異通過(guò)未配對(duì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。顯著性水平由Prism 軟件得出,*P＜0.05 被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠出生1 d 和7 d 心臟組織的變化

按照之前報(bào)道的心尖切除操作方法[14],我們對(duì)出生1 d 和出生 7 d 的小鼠分別進(jìn)行了 AR(圖1A),石蠟切片進(jìn)行HE 染色觀察切口處病理結(jié)構(gòu)(圖1B),與之前研究相一致,術(shù)后21 d 發(fā)現(xiàn)出生1 d 進(jìn)行 AR 的小鼠可以完全再生(再生率為87.67%),而出生7 d 進(jìn)行 AR 的小鼠術(shù)后21 d 無(wú)法再生(再生率為0)(圖1C、1D)。 為了解小鼠出生后7 d 心臟組織的變化情況,我們分別取1 d 和7 d 小鼠完整心臟,稱取小鼠心臟濕重,同時(shí)對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠心臟進(jìn)行拍照比較小鼠心臟大小(圖1E),石蠟切片進(jìn)行HE 染色觀察其病理結(jié)構(gòu)(圖1F),發(fā)現(xiàn)小鼠出生后7 d 心臟組織平均比1 d 心臟濕重重 13.13 mg(3.11 倍)(1 d:(6.22 ± 0.19),7 d:(19.35 ± 0.56),P＜ 0.0001;n=6)(圖 1G)。 心臟成纖維細(xì)胞免疫熒光染色證明,7 d 心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯高于1 d 心臟(圖1H、1I)。 以上結(jié)果說(shuō)明,小鼠出生早期心臟體積隨著心臟發(fā)育增大的同時(shí),心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量也隨之增加。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)分選心臟成纖維細(xì)胞

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)分選心臟成纖維細(xì)胞的圈門(mén)策略

為了分析小鼠出生后7 d 心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量的變化情況,我們使用成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白Thy1 標(biāo)記出生1 d 和7 d 的小鼠心肌成纖維細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選。 首先,我們通過(guò)正向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)散點(diǎn)圖,去除細(xì)胞碎片以及黏連細(xì)胞圈出P1 門(mén)(圖2A),P1 門(mén)中的細(xì)胞開(kāi)展后續(xù)分析。 為了避免背景熒光及自發(fā)熒光的影響,收集分離后未染色的細(xì)胞作為空白對(duì)照(Blank,圖2B);收集加入無(wú)熒光染料的單個(gè)抗體的細(xì)胞作為同型對(duì)照(圖2C),以此判斷抗原抗體的特異性結(jié)合;使用APC 標(biāo)記抗體收集所有APC+細(xì)胞(圖 2D),最后,加入活性染料 7-AAD,收集APC+、7-AAD-的所有細(xì)胞即為T(mén)hy1+的活的心肌成纖維細(xì)胞,即為Q4(圖2E),收集Q4 門(mén)中的所有細(xì)胞,收集5000 個(gè)細(xì)胞后記錄陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

圖1 小鼠出生1 d 和7 d 心臟組織的變化Note, A, Apical resection was performed on day 1 and day 7 mice respectively, the heart was photographed immediately. B,Apical resection was performed on day 1 and day 7 mice respectively, the heart section of the mouse was stained with HE. C, Apical resection was performed on day 1 and day 7 mice respectively,and Masson staining was performed at 21 days after the operation. D,Apical resection was performed on day 1 and day 7 mice,and regeneration rate was counted at 21 day after operation. E,The whole heart of the mouse was photographed on day 1 and day 7. F, The heart section of the mouse was stained with HE on day 1 and day 7. G, The heart weight of the mouse was compared on day 1 and day 7. H,Cardiomyocytes and fibroblasts co-stained in 1 day and 7 days of mouse heart sections. I,Immunofluorescence staining of fibroblasts in 1 day and 7 days of mouse heart sections.Figure 1 Changes of heart tissue in mice on day 1 and day 7

2.2.2 小鼠出生1 d 和7 d 心肌成纖維細(xì)胞比例變化的比較

為明確小鼠出生1 d 和7 d 心臟成纖維細(xì)胞的比例變化,我們?cè)诜诌x的同時(shí)對(duì)心臟組織中成纖維細(xì)胞所占比例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。 按圖1 所示,收集Q4門(mén)中細(xì)胞,收集5000 個(gè)細(xì)胞后記錄陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例,我們共進(jìn)行了3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn),出生后1 d小鼠的心臟組織細(xì)胞中,Thy1+細(xì)胞所占比例分別為6.9%、7.6%、8.7%,7 d 的小鼠心臟組織細(xì)胞中,Thy1+細(xì)胞所占比例分別為9.5%、11.8%、10.4%,因此,小鼠出生后7 d 心臟組織中心肌成纖維細(xì)胞占總細(xì)胞比例比出生后1 d 時(shí)高2.9%(1.38 倍)(1 d: (7.7 ± 0.74),7 d: (10.6 ± 0.95)),P=0.029,t=3.334,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 小鼠出生1 d 和7 d 心臟組織中成纖維細(xì)胞蛋白標(biāo)志物的表達(dá)變化比較

小鼠出生后7 d 心臟組織中成纖維細(xì)胞比例明顯高于出生后1 d 小鼠心臟組織。 為了驗(yàn)證成纖維細(xì)胞在小鼠出生后的性狀變化,我們分別分離了1 d和7 d 的心臟成纖維細(xì)胞,通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)心臟組織中成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白Thy1、Fsp-1、Periostin、Pdgfrα、Col1a1、Tcf21 在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化。以出生1 d 小鼠心臟成纖維細(xì)胞中標(biāo)志蛋白的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)為對(duì)照,比較分析出生后7 d 小鼠心臟成纖維細(xì)胞中標(biāo)志蛋白Thy1、Fsp-1、Periostin、Pdgfrα、Col1a1、Tcf21 的表達(dá),反映心臟中成纖維細(xì)胞的性狀變化。 結(jié)果顯示,與出生后1 d 相比,出生后7 d心臟成纖維細(xì)胞中Thy1、Fsp-1、Periostin的表達(dá)顯著高于1 d 成纖維細(xì)胞(Thy1: 1 d: (1.01± 0.12),7 d: (2.71 ± 0.27),P=0.0288;Fsp-1: 1 d: (1.04± 0.27),7 d: (5.28 ± 0.10),P=0.0046;Periostin:1 d: (0.91 ± 0.01),7 d: (1.13 ± 0.05),P=0.0119;n=3)(圖 3A、3B、3C);而Pdgfrα、Col1a1、Tcf21 的表達(dá)顯著低于1 d 成纖維細(xì)胞(Pdgfrα: 1 d: (1.09 ± 0.04),7 d: (0.62 ± 0.01),P=0.0068;Col1a1: 1 d: (1.00 ± 0.09),7 d: (0.57 ± 0.02),P=0.0433;Tcf21: 1 d: (1.00 ± 0.03),7 d: (0.54± 0.02),P=0.0054;n=3)(圖 3D、3E、3F),由此證明小鼠出生后1 d 到7 d 心臟中成纖維細(xì)胞性狀發(fā)生了改變。

綜上我們發(fā)現(xiàn):小鼠出生早期(1 ～7 d)心臟成纖維比例不斷增加的同時(shí),成纖維細(xì)胞的性狀也發(fā)生了改變,為心臟再生機(jī)制研究提供一定的線索。

3 討論

成纖維細(xì)胞起源于胚胎時(shí)期的間充質(zhì)干細(xì)胞,廣泛分布于心臟、腎、肝、皮膚等器官間質(zhì)中,其細(xì)胞體積大且形態(tài)多樣多變,隨外界微環(huán)境改變而改變[15-16]。 心臟成纖維細(xì)胞是心臟的主要組成細(xì)胞,占整個(gè)心臟組織總細(xì)胞的50%以上[12,17-18],在心臟中發(fā)揮維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用。 本研究主要針對(duì)小鼠出生1 d 和7 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)成纖維細(xì)胞的數(shù)量及性狀的變化情況,發(fā)現(xiàn)小鼠出生后7 d 心臟組織中成纖維細(xì)胞比例明顯高于出生后1 d 小鼠心臟組織;在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平,成纖維細(xì)胞標(biāo)志物Thy1、Fsp-1、Periostin在小鼠出生后 7 d 表達(dá)高于出生后 1 d 的成纖維細(xì)胞,而Pdgfrα、Col1a1、Tcf21三種成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)則低于出生后1 d 的小鼠心臟中的成纖維細(xì)胞,提示在小鼠出生后7 d心臟組織中成纖維細(xì)胞性狀發(fā)生了變化。

表1 小鼠出生后1 d 和7 d 心肌成纖維細(xì)胞比例變化比較Table 1 Comparison of the ratio of cardiac fibroblasts in mouse at 1 day and 7 days after birth

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分選心臟成纖維細(xì)胞的圈門(mén)方法Note, A, All cells were collected without cell debris and adhesion cells. B, Unstained cells were collected as blank control. C, Cell labeled with single antibody without fluorescent dyes were collected as isotype controls. D, The APC+ cells among total cells were collected. E, The APC+,7-ADD- cells among total cells were collected.Figure 2 The ring gate method of sorting cardiac fibroblasts by flow cytometry

成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)大的多向分化潛能[19-20],增殖能力強(qiáng)且代謝旺盛,可體外培養(yǎng)、多次傳代[21-22]。在未受傷的成年心臟中,成纖維細(xì)胞主要作用于營(yíng)養(yǎng)因子的分泌、ECM 監(jiān)測(cè)、傳導(dǎo)系統(tǒng)絕緣、心肌細(xì)胞電偶聯(lián)和血管維護(hù);在損傷的心臟中,成纖維細(xì)胞增殖,沉積ECM,招募炎癥細(xì)胞,是體外機(jī)制探索的重要細(xì)胞類型[23]。 成年哺乳動(dòng)物心臟受損后喪失心肌細(xì)胞增殖能力導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行有意義的自我恢復(fù)[1-2],2011 年,Porrello 研究組發(fā)現(xiàn)新生小鼠出生后1 d 切除約15%的心尖部分,21 d 后心臟可以完全再生,但在出生后第7 d 進(jìn)行心尖切除后只能出現(xiàn)疤痕修復(fù)[4],其中的原理機(jī)制尚不清楚,但是小鼠出生后7 d 成為心臟組織是否可以再生的時(shí)間轉(zhuǎn)折點(diǎn)是確定的。 有研究表明,心臟中成纖維細(xì)胞可以重編程為心肌細(xì)胞,2010 年leda 等[24]將小鼠心肌成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞,首次報(bào)道了成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞的直接重編程。 近幾年,Qian 等[10]、Song[25]等在小鼠心肌梗死部位注射GHMT(Gata4、Hand2、Mef2c、Tbx5)也可引起心臟成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞,為再生醫(yī)學(xué)研究奠定了扎實(shí)基礎(chǔ)。

心臟成纖維細(xì)胞異質(zhì)性很強(qiáng),沒(méi)有特異性表達(dá)的標(biāo)志蛋白,在發(fā)育過(guò)程的不同階段成纖維細(xì)胞表達(dá)的蛋白發(fā)生變化,因此,目前研究者通常使用多種標(biāo)志蛋白組合標(biāo)記的方法對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)識(shí)。Thy1 是目前為止研究最為詳細(xì)的一種細(xì)胞表面糖蛋白,在所有成纖維細(xì)胞中均表達(dá),該糖蛋白通過(guò)糖基磷脂酰肌醇部分固定在細(xì)胞表面,編碼的蛋白經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的處理,生成成熟的蛋白,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用,從而觸發(fā)下游信號(hào)通路,參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過(guò)程[26-27];Fsp-1 為成纖維細(xì)胞分泌因子,在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中高度表達(dá),對(duì)維持細(xì)胞生物學(xué)功能起著重要作用[28-29];Periostin是肌成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中的非結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白,在正常心臟中幾乎不表達(dá),但是在受損的心臟中高度表達(dá),是一種相對(duì)較新的潛在標(biāo)志物,可用于鑒定心肌成纖維細(xì)胞,促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的募集并增加膠原蛋白的產(chǎn)生[30]。Col1a1是Ⅰ型膠原的主要成分,可用于鑒定心臟成纖維細(xì)胞,并與pdgfrα共同表達(dá)[31];pdgfrα是酪氨酸蛋白激酶家族成員,具有促進(jìn)細(xì)胞趨化分裂增殖、細(xì)胞趨化、血管收縮及參與組織器官的生成分化等生物效應(yīng);Tcf21 在心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá),與其他標(biāo)志物一起鑒別心臟成纖維細(xì)胞[32]。 我們的結(jié)果顯示,小鼠出生后7 d 成纖維細(xì)胞占整個(gè)心臟組織的比例較出生后1 d 心臟組織升高了2.9%,成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物Thy1、Fsp-1、Periostin、Pdgfrα、Col1a1、Tcf21表達(dá)水平也發(fā)生了顯著改變,提示此過(guò)程中成纖維細(xì)胞細(xì)胞性狀發(fā)生了一定程度的改變,可能與小鼠出生7 d 后再生能力丟失相關(guān),進(jìn)一步探討小鼠出生7 d 心臟成纖維細(xì)胞的變化與心肌再生關(guān)系和機(jī)制,有可能為尋找出心肌再生關(guān)鍵的靶點(diǎn)提供新的研究方向。

圖3 小鼠出生1 d 和7 d 心臟成纖維細(xì)胞標(biāo)志的變化Note.Compared with 1 day group, *P＜0.05,**P＜0.01.Figure 3 Changes of cardiac fibroblast markers in mouse at 1 day and 7 days after birth

隨著科學(xué)界對(duì)心肌成纖維細(xì)胞功能的不斷深入研究,發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞在心臟生理及病理?xiàng)l件下的作用越來(lái)越重要,成為心血管領(lǐng)域的重要研究對(duì)象。 本研究主要著眼于小鼠出生后1 d 和出生后7 d 心臟成纖維細(xì)胞的數(shù)量和心臟成纖維細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)分析,為心肌再生領(lǐng)域的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論線索。