蒙藥香青蘭總黃酮對帕金森病模型小鼠的神經保護作用

周麗麗,莫超然,劉心朗,孫毅紅,賈建新,楊占君

(內蒙古科技大學包頭醫學院,內蒙古包頭 014040)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常見的神經退行性疾病之一,臨床表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態異常[1],其主要病理學特征為黑質致密部和紋狀體多巴胺能神經元漸進性丟失和路易小體的形成[2]。 目前,針對PD 患者的主要治療手段均可改善預后,但其確切地發生發展機制尚不清楚[3-4]。

氧化應激被認為是PD 發病機制中的一個重要因素[5]。 在正常情況下,機體存在氧自由基清除系統,腦組織內主要有超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)等保護機體免遭氧自由基的損傷。 脂質降解的毒性產物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量能夠體現機體清除自由基的作用。 帕金森病患者多巴胺能神經元變性的基本形式是細胞凋亡[6],許多基因及其產物可以參與多巴胺能神經元變性的凋亡過程。

蒙藥香青蘭(Dracocephalum moldavica L.)是蒙古族習用數百年的天然藥材,香青蘭中的成分極其復雜,現已測得含有微量元素、揮發油、氨基酸、有機酸、多糖類、黃酮、甾體、萜類等[7]。 其中,黃酮類化合物含量豐富,且具有較強的抗氧化性[8]。 前期研究證明, 香青蘭總黃酮( total flavones of Dracocephalum moldavica L., TFDM)在腦缺血再灌注損傷中具有抗氧化和抑制細胞凋亡的作用[9-10],但其是否與PD 發病相關仍未見明確報道。 因此,本實驗研究TFDM 對PD 模型小鼠的運動功能、多巴胺能神經元丟失與細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

40 只 8 周齡 SPF 級雄性 C517BL/6J 小鼠(22±2)g,購自北京維通利華有限公司[SCXK(京)2019-0010]。 實驗動物均飼養在內蒙古科技大學包頭醫學院SPF 級動物房中[SYXK(京)2017-0033],室溫(22 ± 1)℃,晝夜循環 12 h,小鼠可自由進食、飲水。 動物房所有動物實驗遵循我國《實驗動物護理和使用指南》和“3R”原則執行。 動物實驗由內蒙古科技大學包頭醫學院醫學生物學研究所動物實驗倫理審查委員會通過(2016-033)。

1.2 主要試劑與儀器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)購自美國sigma 公司;香青蘭植物由內蒙古科技大學包頭醫學院楊占君教授鑒定;TFDM 由包頭醫學院公共衛生學院提供;SOD、MDA、GSH-Px 試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司;β-actin、Caspase-3、Bcl-2、Bax、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體購自Affinity Biosciences.;組織裂解液、蛋白酶抑制劑、IgG-HRP 抗體購自北京索萊寶生物技術有限公司;免疫組化試劑盒、ECL 化學發光試劑盒購自北京中杉金橋科技有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo;轉棒式疲勞儀(型號:XR1514-RZPM)購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 TFDM 的提取和含量測定

采集香青蘭植物的地上部分研磨成粗粉,取300 g 植物粗粉放入三頸燒瓶,加入1500 mL 65%乙醇,浸泡過夜。 第2 天,將三頸燒瓶放入70℃水浴、當燒瓶內溫度達到60℃時,連續攪拌2 h。 然后通過真空濃縮過濾得到香青蘭總黃酮醇溶液,利用旋轉蒸發儀減壓蒸餾蒸發掉乙醇溶液和水,最終得到香青蘭總黃酮,經過紫外分光光度計測量總黃酮含量。

1.3.2 動物分組及給藥

40 只小鼠隨機分為正常對照組(8 只)與模型組(32 只),模型組小鼠腹腔注射 30 mg/(kg·d)MPTP,正常對照組(normal control)注射等體積生理鹽水,連續7 d。 繼續飼養,將模型組小鼠隨機分為模型組(model)、TFDM 低(TFDM-L,10 mg/kg)、中(TFDM-M,20 mg/kg)、高(TFDM-H,30 mg/kg)給藥治療組,每天每組小鼠給與相應藥物灌胃處理;正常對照組和模型組均給與等體積生理鹽水灌胃處理,連續1 個月。

1.3.3 行為學評價實驗

(1)轉棒實驗

將小鼠置于轉棒式疲勞儀上,給予30 s 的適應時間,然后啟動轉棒式疲勞儀,使轉棒轉速在30 s內達到26 r/min,記錄小鼠第一次從棒上跌落的時間(潛伏期)。 每只小鼠測3 次,每次間隔30 min,取平均值。

(2)爬桿實驗

取50 cm 長,1 cm 粗鐵桿作為爬桿,爬桿上纏繞醫用膠布防止打滑,各組小鼠在實驗前1 周每天一次訓練,于最后一次給藥治療結束進行檢測。 檢測時,將小鼠放置于爬桿上端,以小鼠雙前上肢接觸桿底平臺認定為爬完全程,記錄爬完全長所需時間,每只爬桿3 次,取平均值。

1.3.4 組織取材

麻醉小鼠后,快速取出完整的腦組織,一部分在冰上取黑質區域(結合小鼠腦組織圖譜,黑質區位于前囟 2.46 ～4.04 mm,中線外 0.24 ～1.34 mm[11])于-80℃保存待用;一部分于4%多聚甲醛固定浸泡過夜。 采血針腹主動脈取血,全血靜止30 min、4000 r/min,離心 15 min,取上清于-80℃保存待用。

1.3.5 ELISA 檢測

取出-80℃血清,分別按照SOD、MDA、GSH-Px試劑盒說明進行操作,每組血清全部按照1:10 稀釋進行檢測。

1.3.6 免疫組織化學實驗

將固定好的腦組織進行石蠟包埋切片,切片進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后、抗原修復10 min,內源性過氧化物酶反應15 min,PBS 洗3 次× 10 min,然后滴加一抗(TH 1 ∶1000,Caspase-3 1 ∶500,Bcl-2 1 ∶500, Bax 1 ∶500)4℃ 孵育過夜。 第二天,滴加二抗(IgG 1 ∶1000)室溫孵育 20 min,PBS 洗 3 次×10 min,DAB 顯色3 min,蘇木素復染30 s,乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片。 在光學顯微鏡下觀察并采集圖像,利用Image J 軟件分析統計陽性細胞數目。

1.3.7 Western blot 檢測

取出 - 80℃腦組織加入組織裂解液研磨、超聲破碎,再加入蛋白酶抑制劑冰上反應30 min,12000 r/min 4℃低溫離心15 min,取上清,BCA 法測定蛋白濃度。 電泳100 V 2.5 h,轉膜400 mA 2 h,5% 脫脂奶粉封閉 1.5 h,孵育一抗(β-actin 1 ∶1000、TH 1 ∶1000、Caspase-3 1 ∶1000、Bcl-2 1 ∶1000、Bax 1 ∶1000)4℃過夜。 第二天,TBST 洗滌 3 次×10 min,孵育二抗(IgG 1 ∶3000)2 h,TBST 洗滌 3 次×10 min,ECL 發光液顯影并采集蛋白條帶,通過 Image J 軟件處理分析統計。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 香青蘭總黃酮化合物的分離提取和含量測定

經旋轉蒸發儀減壓蒸餾得到粉末狀的香青蘭總黃酮化合物提取物,電子天平稱量為50.5 g;利用紫外分光光度計測量得到總黃酮含量為322.8 mg/g。

2.2 TFDM 對PD 模型小鼠運動功能的影響

在轉棒實驗中,與正常對照組相比,模型組小鼠下落潛伏期顯著降低(P＜0.01),與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組下落潛伏期顯著增高(P＜0.05),低劑量治療組沒有顯著變化(P＞0.05),見圖1a;在爬桿實驗中,與正常對照組相比,模型組PD 小鼠的爬桿時間明顯增高(P＜0.05),與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組爬桿時間顯著降低(P＜0.05),低劑量治療組沒有顯著變化(P＞0.05),見圖1b。

2.3 TFDM 對PD 小鼠血清中氧化應激因子的影響

ELISA 檢測結果顯示,與正常對照組相比,模型組血清中 MDA 的含量顯著升高(P＜0.01),同時GSH-Px、SOD 的表達顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,TFDM 各治療組MDA 的含量明顯降低(P＜0.05),GSH-Px 的表達明顯升高(P＜0.05),而中、高劑量治療組SOD 的表達明顯升高(P＜0.05),低劑量治療組SOD 的表達沒有明顯變化(P＞0.05),見表1。

圖1 TFDM 對帕金森模型小鼠運動功能影響(n=8,ˉx ± s)Note. A, Normal control group. B, Model group. C, TFDM-L. D,TFDM-M. E, TFDM-H. a, Rota Rod test. b, Climbing Pole test.Compared with control group, *P＜0.05, **P ＜0.01. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 1 Effects of TFDM on motor function in Parkinson’s model mice in each group

表1 TFDM 對PD 小鼠血清中氧化應激因子的影響( ,n=8)Table 1 Effects of TFDM on oxidative stress factors in serum of PD mice

表1 TFDM 對PD 小鼠血清中氧化應激因子的影響( ,n=8)Table 1 Effects of TFDM on oxidative stress factors in serum of PD mice

注:A:正常對照組;B:模型組;C:低劑量組;D:中劑量組;E:高劑量組。 與對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05。Note. A,Normal control group. B,Model group. C,TFDM-L. D,TFDMM. E, TFDM-H. Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Compared with model group, #P＜0.05.

組別Groups SOD (U/mL) GSH-Px (mIU/mL) MDA (nmol/mL)A 85.03 ± 4.46 20.07 ± 0.62 1.14 ± 0.03 B 57.84 ± 3.59* 14.67 ± 0.49* 2.70 ± 0.33**C 62.72 ± 2.62 19.06 ± 0.62# 2.03 ± 0.16#D 66.89 ± 4.10# 18.38 ± 0.60# 1.67 ± 0.12#E 70.43 ± 3.66# 17.17 ± 0.58# 1.51 ± 0.11#

2.4 TFDM 對 TH 和凋亡相關蛋白 Caspase-3、Bcl-2、Bax 表達的影響

2.4.1 免疫組織化學

在細胞質可見 TH、Caspase-3、Bcl-2 和 Bax 蛋白的陽性表達,免疫組化圖像上細胞的胞核顯色為藍色,胞質顯色為深棕黃色,確定為蛋白陽性表達細胞。與正常對照組相比,模型組TH、Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低,陽性細胞數目明顯減少(P＜0.05),同時Caspase-3、Bax 表達水平顯著增加,陽性細胞數目明顯增加(P＜0.05);與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組TH、Bcl-2 蛋白表達水平明顯上調,陽性細胞數目增加(P＜0.05),同時 Caspase-3、Bax 表達水平明顯下降,陽性細胞數目減少(P＜0.05),低劑量治療組沒有明顯變化(P＞0.05),見圖 2a、2b、2c、2d。

圖 2 TFDM 對 TH、Caspase-3、Bcl-2 和 Bax陽性細胞表達的影響( ,n=4)Note. A, Normal control group. B, Model group. C, TFDM-L. D,TFDM-M. E, TFDM-H. a, b, c and d respectively represent the statistical results of TH, Caspase-3, Bcl-2, Bax immunohistochemical images and positive cells statistics The arrow positive cells that indicate protein expression. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 2 TFDM effects on TH, Caspase-3,Bcl-2 and Bax positive cells expression

2.4.2 Western bolt

與正常對照組相比,模型組TH、Bcl-2、Bcl-2/Bax蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),同時Caspase-3、Bax 表達水平顯著增加(P＜0.05);與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組 TH、Bcl-2、Bcl-2/Bax 蛋白表達水平明顯上調(P＜0.05),同時 Caspase-3、Bax 表達水平明顯下降(P＜0.05),低劑量治療組沒有明顯變化(P＞0.05),見圖 3b、3c、3d、3e、3f。

3 討論

帕金森病已成為繼阿爾茲海默癥后第二常見的中老年神經退行性疾病,而且發病率隨著年齡的增長而增加[12]。 目前,針對PD 患者的治療藥物主要分為消耗多巴胺或模擬多巴胺受體效應的藥物[13],而這類藥物只能改善臨床運動癥狀,不能阻止或逆轉疾病進展,長期使用還會導致嚴重的運動并發癥。 因此,降低不良反應,尋找新的、行之有效的治療策略是目前研究的重點。

香青蘭,又名青蘭、摩眼子、枝子花等,屬唇形科青蘭屬植物,性味辛苦涼,具有清熱燥濕、涼肝止血的功效。 有研究顯示TFDM 具有較強的抗炎性、抗氧化作用,并對低氧環境所致的肺損傷具有保護作用[14-15]。 TFDM 可能通過抑制細胞的凋亡和自噬對心肌細胞缺氧復氧損傷有顯著保護作用[16-17]。TFDM 還具有減緩動脈粥樣硬化的作用[18]。

MPTP 因其高度的脂溶性可進入腦內并在單胺氧化酶B 的作用下轉化為1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),低濃度可誘發腦黑質細胞凋亡、多巴胺能神經元漸進性丟失,誘導動物PD 的發生發展[19-20]。大量研究顯示,PD 模型小鼠的運動功能異常且多巴胺能神經元數目減少[21-22]。 爬桿實驗和轉棒實驗主要檢測PD 小鼠的運動協調能力[21]。 本實驗研究結果顯示,MPTP 制備的PD 模型小鼠多巴胺能神經元減少,多巴胺分泌減少,導致興奮性神經遞質乙酰膽堿功能亢進,引起肌張力持續增高、運動遲緩,導致小鼠的運動功能發生障礙,證明PD 的模型建立成功。 經過TFDM 治療小鼠的爬桿時間縮短、下落潛伏期增加,證明小鼠的運動速度增加,運動協調能力提高,說明香青蘭總黃酮能夠改善PD小鼠的運動功能。 免疫組化結果顯示TFDM 治療小鼠的多巴胺能神經元表達明顯增多,證明香青蘭總黃酮可以減緩多巴胺能神經元的漸進性丟失,說明香青蘭總黃酮對PD 有神經保護作用。

正常生理條件下,腦組織內的活性氧(ROS)可被機體抗氧化酶和抗氧化物質清除。 當PD 發生時,隨抗氧化物質含量下降,神經元清除自由基能力降低,從而引起黑質脂質過氧化增強,MDA 含量增加[23]。 也有學者證實帕金森病患者黑質部GSH水平下降40%[24],SOD 活性也有所降低。 本研究結果顯示,TFDM 可以減輕氧化應激的損傷,使MDA含量降低的同時提高SOD、GSH-Px 的活性。

凋亡是由多種分子調控的復雜過程,這些分子包括 Bax、Caspase-3,或者是 Bcl-2 和 Bcl-xl 等。Caspase 家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件,當細胞接受凋亡刺激時激活Caspase-3,進而誘導細胞發生凋亡,凋亡開始即呈級聯放大效應。 Bcl-2 家族是細胞凋亡最重要的調節因子之一[25]。 Bcl-2 可以抗細胞凋亡,Bax 可以促細胞凋亡[26],在調控條件下,Bcl-2 家族中抗凋亡和促凋亡蛋白的表達相對穩定[27]。 兩蛋白間的比例決定是否發生細胞凋亡[28],當Bcl-2/Bax 比值較低則細胞凋亡較重,反之則細胞凋亡較輕[29]。 本研究結果顯示,TFDM 可以通過降低Caspase-3、Bax 蛋白表達水平的同時增加Bcl-2 蛋白的表達水平來抑制細胞凋亡對PD 小鼠的影響。 由于細胞凋亡是一個復雜的過程,TFDM具體通過哪個環節對PD 小鼠起到神經保護作用還不明確,還有待進一步的研究。

圖 3 TFDM 對 TH、Caspase-3、Bcl-2、Bax 和 Bcl-2/Bax蛋白表達的影響( ,n=4)Note. A, Normal control group. B, Model group. C, TFDM-L. D,TFDM-M. E, TFDM-H. a, Group protein Western blot image bands. b, c, d, e, and f, The statistical results of TH, Caspase-3, Bcl-2, Bax and Bcl-2/Bax protein expression level. Compared with control group, *P ＜0.05. Compared with model group,#P＜0.05.Figure 3 TFDM effects on TH, Caspase-3, Bcl-2,Bax and Bcl-2/Bax protein expression

綜上所述,TFDM 對PD 模型小鼠具有改善運動功能障礙和減少多巴胺能神經元丟失的作用,并可能通過抑制Caspase-3 蛋白活性、上調Bcl-2 和下調Bax 蛋白表達在PD 模型小鼠發揮神經保護作用。