運用制動法建兔KOA 分期模型的合理性分析

金曉飛,楊郁鵬,趙季宇,曹韻茗,李佳茹,郝重耀

(山西中醫藥大學第三臨床學院,山西晉中 030619)

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis, KOA),臨床常被稱膝關節炎、膝骨病、膝骨關節炎等,中醫學中也稱作“膝痹”“鶴膝風”,其臨床發病原因多樣,且病情多嚴重。 因體質、耐受等不同,現代醫學中尚未有一種方法可以準確診斷其分期[1-2],目前該病的臨床診斷多采用DR/CT/MRI 等,這些技術的使用,為疾病的診斷提供了一定的參考,但對疾病的發展分期把握尚有不足,醫者在分期診斷時會存在一定的誤診風險,進而可能會錯失最佳的治療,使得病情延誤。 因此迫切需要一種方法來對膝關節炎進行分期的劃分,以便更好地指導臨床應用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 月齡健康清潔級日本大耳白兔40 只,雌雄各半,體重(2.25±0.1) kg,實驗動物由北京市昌揚西山養殖場提供[SCXK(京)2016-0007],中國食品藥品檢定研究院檢測,飼養于山西中醫藥大學實驗中心清潔級動物實驗室[SYXK(京)2016-0034]),溫度20℃,濕度50%～55%,單籠飼養50 cm×40 cm×40 cm,標準飼料喂養,造模期間兔子自由飲水攝食,動物實驗研究的倫理審批單位為山西中醫藥大學醫學倫理委員會(2020DW086),實驗研究過程做到了3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

石膏繃帶(15 cm×460 cm 浙江安吉華埠實業有限公司);嬰兒秤(上海花潮電器有限公司ER70型);切片機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司YGQ-III);石蠟包埋機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司YB-6LF);顯微鏡(日本尼康株式會社Nikon H550 L)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組

40 只日本大耳白兔,按照隨機數字表進行分組為模型 1 組、模型2 組、模型3 組、模型4 組,每組樣本量10 只。

1.3.2 模型制備

改良后的Videman 法左后肢伸直位固定制動法制備KOA 模型[3-4]:造模前動物禁食10 h,采用3%烏拉坦耳緣靜脈麻醉30 mg/kg,剪去左后肢踝關節以上兔毛,牽拉踝部使膝關節完全伸直位,先用常規紗布纏繞,外用棉棒輔助(因為兔膝關節力量較大,伸直位時用兩側鈍頭的棉棒行輔助固定,固定膝前后),后用石膏繃帶經20℃～30℃熱水浸泡5 ～10 s 軟化后,從腹股溝到趾頭行制動術,已膝關節髕骨為中心進行纏繞包裹,足趾不予覆蓋留以觀察血供,石膏硬化后,外層以透明膠紙再次固定,以防脫落。 若繃帶松動或脫落及時重新固定。 如足趾充血嚴重或足趾發黑,立刻拆除繃帶,待腫退后再行固定。 如膝部撕咬損傷后一律剔除,累積制動分別達 10 d、20 d、30 d、40 d,造模結束 1 周后進行相關取材。

在造模期間各組兔子沒有死亡,膝關節無腐爛等損傷,造模均達到相應的制動周期,數據完整,無脫落。

1.3.3 觀察

(1)行為學觀察

分別于造模前1 d 和各組造模結束后參考改良Lequesne MG 的膝關節級別評估量表[5],對各組兔的膝關節活動情況、疼痛狀態、關節腫脹程度等進行檢驗,予以評分。

(2)形態學觀察

各組造模結束,均予以空氣栓塞法處死動物,打開各組膝關節, 取膝周組織, 進行JessicaBadendick 大體形態評分[6],對各組兔的軟骨顏色、關節炎范圍大小、軟骨的質地和厚度等進行評估。

(3)病理觀察(HE 染色)

取下的軟骨和韌帶,用4%組織固定液固定24 h,后常規石蠟包埋,5 μm 厚度連續切片,HE 染色后顯微鏡下觀察,要求觀察位置固定。

1.4 統計學方法

實驗數據采用SPSS 24.0 統計軟件進行分析,計量資料結果以平均數±標準差()表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗,組內比較采用獨立驗本t檢驗。 統計結果以P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔膝關節Lequesne MG 的膝關節級別評估

在膝關節骨性關節炎的發展過程中,疾病隨受損傷時間的延長而出現了明顯的階段變化,其大致可分為四個階段,早期、初期、中期、晚期,其中晚期的癥狀最為嚴重。

如圖1 所示隨著造模時間的延長,膝關節評分呈現上升趨勢,其中造模1/2/3 組間的差距較為顯著,造模3/4 組間差距較小。 4 組造模后,模型組動物關節部位已經完全僵化,不可彎曲(I 級0 分,II級 1-4 分,III 級 5-8 分,IV 級 9-11 分)。

隨著造模時間的延長,膝關節的評分呈現上升趨勢,其中造模1/2/3 組間的差異較為顯著,造模3/4 組間差距較小。 第4 組造模后,模型組動物關節部已經完全僵化,不可彎曲。 (Lequesne MG 的膝關節評分可分為四級,I 級0 分,II 級1-4 分,III 級5-8 分,IV 級 9-11 分)。 本次實驗結果可見(圖 1A/1B)。

2.2 各組兔膝關節 JessicaBadendick 大體形態評分

圖2 和圖3 為各組結束造模之后的各組關節評分情況和各組軟組織取材情況,可見各組差異明顯:模型1 組,在軟組織表面出現部分的黃染,光澤減退,組織緊密程度略有改變,但整體致密。 模型2組組織出現了血色分布,且組織顏色進一步加深,黃染嚴重,但仍有光澤尚存,組織的緊密度進一步下降,在組織與關節的連接處已經出現了少量的粘連。 模型3 組組織的軟組織血色分布已經沾滿了組織的1/2 以上,組織顏色暗淡無華,組織的緊密度已經出現了部分的降解,關節粘連嚴重,軟組織已經粘連與關節骨面之上。 模型4 組關節的軟組織表面已經完全布滿血絲,組織變得松軟粘稠,不易取出,軟組織體積已經達到了最大,與周圍的關節粘嚴重,有的已經完全粘連不易松解。

2.3 關節病理切片觀察

圖4 為各組髕韌帶HE 染色結果展示:模型1組,染色整體完整,部分出現脫落,血管翳出現較少,細胞核的排列稍微出現不齊,與空白組相比差距較小。 模型2 組,染色脫落嚴重,血管翳增多,細胞核的排列出現了嚴重的混亂。 模型3 組,染色脫落嚴重,血管翳持續增加且血管翳混亂,細胞核著色困難,只有少數可見,排列混亂嚴重。 模型4 組,染色脫落完全,視野中已經沒有細胞核可見,血管翳持續增加,視野中隨處可見。

圖1 各組Lequesne MG 的膝關節級別評估Note. As shown in figure1B, there were significant differences in the knee behavior of each model group,P＜0.05.Figure 1 Evaluation of knee joint grade in each group

圖2 各組兔膝關節Jessical Badendick 大體形態評分Note.B,There were significant differences in the gross morphological scores of Jessicabadendick among different tissues of rabbit knee,P＜0.05。Figure 2 Morpjoiogical evaluation of jessicabadendick of knee joint in each group

圖3 空白組與模型各組關節軟組織取材Figure 3 The joint soft tissue samples were collected from the blank group and the model group

圖4 空白組與模型各組髕韌帶HE 染色結果Figure 4 HE Staining results of patellar ligament in blank group and model group

3 討論

膝關節骨性關節炎,作為一種慢性組織損傷性疾病,西醫學認為該病的發生是由于局部的損傷,導致的關節軟骨的病理性退變使得局部的組織分解、粘連所導致。 中醫把該病歸屬于“痹癥”[7],有記載“風寒濕三氣雜至,合而為痹”,認為該病的發生是由于多種原因使得膝關節局部氣滯血瘀,膝部的經脈、經筋等組織病變,進而產生萎縮、痙攣從而不能發揮其正常的生理功能。 目前針對該病的治療方法多樣[8],(1)非藥物療法:如功能鍛煉[9]、物理療法和健康教育等[10]多適用關節炎的早期。(2)西醫療法:非甾體抗炎藥、軟骨保護劑、關節腔藥物注射、手術療法等[11]。 (3)中醫療法:中醫方劑、外用貼敷藥、中醫針灸等[12]。 (4)其他療法:基因療法。 由于膝關節炎的發病機制尚未完全清楚,以上的治療方法均為對現存主要癥狀的治療活或改變致病的因素,但疾病的發展過程中疾病的外在表現往往略遲于病情的發展。 所以合理把握疾病發展的內在分期,繼而采取相對應的治療顯得尤為重要。

本課題組采用石膏制動制備模型,經行為學觀察和病理檢測,成功制造了膝關節炎模型。 目前,西醫學中對膝關節骨性關節炎尚未進一步劃分,中醫學中關于膝關節骨性關節炎的分型也尚未有完全統一的認識,其致病因素多為感受風、寒、濕、熱等外在致病因素所致以及內在的痰、瘀等病理產物所致,其分型大致分為:氣滯血瘀證、濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證[13],本次實驗是通過石膏制動,使得膝關節局部氣血運行受阻,產物代謝失常,膝關節充血,最終制造瘀血型膝關節骨性關節炎模型。 對上述數組實驗動物的行為學評分和病理檢測進行數據統計與分析,提示組間差距顯著。 因此我們推測膝關節骨性關節炎的發展進程可大致分為初期、早期、中期、晚期四個階段。 且由于外在的石膏制動持續存在,使得病情的發展呈持續加重的趨勢。 在制動的早期階段,關節部組織已經發生了損傷,在組織表面的光澤度已經下降,血管翳雖然尚未出現,但已經有部分的黃染,可能是制動使得局部缺氧導致。 中醫認為該病的初期階段外在或者內部的損傷作用,使得膝部的經筋、韌帶以及軟骨等組織血供出現障礙,因此組織出現了最初的病變,此時只會表現出局部感覺的略微不適,尚不會對日常的生活生產造成影響,因此最容易被忽視,導致疾病的進一步發展。 在制動的20 d 左右,膝部關節的不適感會增強,實驗中動物表現出撕咬等狀況,且解剖發現組織的光澤度下降,黃染嚴重,顏色如煙熏,該階段病情呈加重,不適感進一步加強。 在制動的30 d 左右,膝部的不適感持續增加,解剖可見軟組織黏性增強,出現了部分分解,組織分解粘連在關節的活動處,造成了關節活動的障礙,外在表現多為關節的屈伸不利,解除制動,關節活動也有明顯的障礙,對生活影響較大。 在制動的40 d 左右,膝部關節已經完全粘連,解除制動屈伸嚴重受限,解剖可見骨關節已經完全被分解的組織粘連,關節腔嚴重狹窄。

該次實驗模型的制備制備采用了石膏制動法,造模過程中兔左后肢出現了腫脹、充血黑青等外在表現,肉眼清晰可見,且通過對患者的解剖學觀察可見膝關節腔各組織出現了血管翳的錯雜分布以及黃染,因此可以充分證明該模型可以對應臨床的血瘀型關節炎。 中醫學中認為瘀血的出現是多種致病因素作用的結果,如:氣滯血瘀、痰凝血瘀等。可見瘀血是多種疾病后期的必要表現,在關節炎發生中瘀血幾乎可以伴隨疾病的發生全過程,且在治療過程中也常常出現。 所以在關節炎的研究中應該予以重視。 另外本次實驗中我們對制動造模后的KOA 關節炎進行了分期,這可以說是本文的創新點之一,目前尚未發現此類的研究,本次實驗在中醫認為的淤血型關節炎基礎上,再次結合西醫學的病理評分劃分分期,有效結合了中西醫學關于該病的認識,進而把握該型關節炎,可能為精準醫學的發展提供必要的參考,針對不同的分期采取相應的治療也可能更加有利于關節炎的治療。

綜上所述,損傷是導致關節炎產生的一種重要原因,在膝關節炎的防治中,及早解除外在的損傷性因素可能是最為關鍵的一環。 上述實驗可見,關節炎的發展進程中,會有明顯的幾個階段,可以大致分為初期、早期、中期、晚期。 但是當前的多種技術如x 線,多通過骨刺的形成來鑒別,我們通過解剖觀察認為骨刺的形成可能是多種病理產物堆積的結果,多出現在關節炎的后期,骨刺一旦形成,常規的中藥療法和運動療法療效較差。 因此合理地盡早地把握各個階段的病理特征,對癥治療才能更好地防治病情。 我們希望對關節炎模型的合理性分期做一種嘗試并加以論述,為之后的實驗做一定的參考。