短期低頻電刺激對長距離陳舊性(8 周)周圍神經缺損再生能力的影響

焦海山,宋悅寧,肖 波,黃 健,李東印

(1.蘇州衛生職業技術學院基礎醫學教研室, 江蘇蘇州 215009; 2.蘇州衛生職業技術學院臨床醫學教研室,江蘇蘇州 215009)

周圍神經損傷在臨床上較為常見,按治療原則應盡早恢復神經的連續性,但由于臨床損傷的復雜性,受各種主觀、客觀條件影響,在急性期未得到及時處理而演變為陳舊性損傷的病例仍較多。 相對于急性神經損傷,陳舊性神經損傷中近端神經元的成活率,遠端維持再生神經生長的微環境等條件皆較差,尤其是失神經支配的遠側斷端和靶器官的等待時間將比急性損傷直接修復長,導致陳舊性神經損傷修復效果較差[1-4]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雌性SPF 級SD 大鼠30 只由中科院上海實驗動物中心提供[SCXK(滬)2017-0005],7 周齡,體重160～180 g 左右,隨機分為缺損8 周自體神經修復+SLES 組(實驗組,n=15),缺損8 周自體神經修復組(對照組,n=15)。 動物實驗在蘇州大學實驗動物中心完成[SYXK(蘇)2016-0049]。 動物實驗研究由蘇州衛生職業技術學院實驗動物倫理委員會審查并批準(SWAE202002),動物實驗過程遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠抗生長相關蛋白-43 (growth-associated proteins 43,GAP-43)單抗、兔抗腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)多抗、羊抗小鼠 IgG-FITC 二抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗、小鼠抗神經絲蛋白(neurofilament, NF)單抗、兔抗可溶性蛋白-100(soluble protein-100, s-100)多抗(以上抗體皆來自武漢博士德生物工程有限公司);熒光金(Fluoro-Gold,FG)逆行示蹤劑(Fluorochrome 公司, 美國);TI CFIS60 倒置熒光顯微鏡(Nikon 公司,日本);JEM1230 透射電鏡(JEOL 公司,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備、修復及一般觀察

以含3%的戊巴比妥鈉的復合麻醉劑(30 mg/kg)對動物進行腹腔注射麻醉,麻醉成功后,選取左側股中部切口,在無菌條件下切開并鈍性分離暴露左側坐骨神經,在股中部位置切除大鼠坐骨神經6 mm,神經切除后,將近、遠側斷端神經分別翻轉180°,以9-0 醫用錦綸單絲線(上海浦東金環醫療用品有限公司)將神經斷端分別縫合固定在不同的肌間隙中,避免神經自發再生。 手術完成后將動物繼續飼養8 周,同前麻醉、自原切口無菌條件下進入,暴露損傷側坐骨神經,修剪近、遠側神經斷端,制成大鼠坐骨神經13 mm 缺損延遲8 周修復的陳舊性神經缺損模型。 無菌條件下切取對側股中部13 mm 長正常坐骨神經橋接至左側坐骨神經缺損。實驗組動物在橋接后采用BL-420F 生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)施以SLES 處理:陰性電極固定在近側端神經干上,陽性電極固定于神經附近的骨骼肌上,予以1 h 的低頻(20 Hz)方波電刺激(3 V, 0.1 ms),對照組橋接后同前放置電極,但不予刺激。 手術完成后縫閉切口,除用于觀察神經元相關因子表達情況的動物外,皆繼續常規飼養3個月取材。

1.3.2 取材觀察

(1)神經元中相關因子表達觀察

諾貝麗斯（Novelis）是全球領先的鋁壓延產品制造商，以及全球最大的鋁回收利用公司。諾貝麗斯的運營覆蓋全球10個國家，擁有約11 000名員工，其2017財年的收入約為100億美元。諾貝麗斯為北美洲、歐洲、亞洲和南美洲的運輸、包裝、建筑、工業和消費電子市場提供優質鋁板和鋁箔產品。諾貝麗斯是鋁和銅領域全球領導者印度鋁工業有限公司（Hindalco Industries Limited）的子公司。

隨機選取實驗組、對照組修復術后1、2、7 d 的實驗動物各2 只,同前麻醉后,經心臟灌注,取脊髓L4—L5 節段以及相應的背根節,經4%多聚甲醛后固定等處理后,冰凍切片,作抗GAP-43、BDNF 免疫熒光組織化學染色,(一抗:小鼠抗GAP-43 單抗,1 ∶300;兔抗 BDNF 多抗,1 ∶200;二抗:羊抗小鼠 IgG-FITC,1 ∶250;羊抗兔 IgG-TRITC,1 ∶250),TI CFIS60熒光顯微鏡觀察并記錄圖像。

(2)熒光金逆行示蹤實驗

動物第2 次手術后3 個月,隨機選取實驗組和對照組3 只動物,同前麻醉后,在遠側吻合口以遠5 mm 處使用微量進樣針給每只動物注射5%FG 逆行示蹤劑10 μL,動物注射示蹤劑后繼續飼養1 周取材,選取脊髓腰膨大段(L4—L5)以及相應的背根節,常規后固定等處理后冰凍切片,熒光顯微鏡觀察并記錄圖像。 使用Abercrombie 等[11]報道的方法計數FG 標記的神經元數量。

(3)神經肌肉形態學觀察和計量

剩余動物第2 次手術后3 個月取材,同前麻醉,切取實驗側腓腸肌,稱重并計算相對濕重比(術側腓腸肌重量/體重×100%),常規后固定梯度蔗糖沉底后冰凍切片,作Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組化染色,顯微鏡觀察并記錄圖像。

切取橋接物及兩端相連的神經,每組隨機選取3 只,切取遠端吻合口以遠5 mm 處神經作電鏡標本處理,常規鈾-鉛染色,JEM1230 透射電鏡觀察。 圖像分析系統進行圖像處理,計算有髓神經纖維軸突直徑及髓鞘厚度等指標。

其余3 只選取橋接物中段作冰凍切片,分別作神經三色染色和抗NF、S-100 免疫熒光組織化學染色(一抗:小鼠抗 NF 單抗,1 ∶400;兔抗 S-100 多抗,1 ∶200;二抗:羊抗小鼠 IgG-FITC,1 ∶250;羊抗兔 IgGTRITC,1 ∶250),熒光顯微鏡觀察并采圖。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 神經元中相關因子表達觀察

實驗組脊髓運動神經元(圖1)和背根節(圖2)感覺神經元GAP-43 和BDNF 的表達在修復后1 ～2 d 增加,7 d 后逐漸下降。 而對照組修復術后 1、2、7 d,兩種因子的表達上調較為緩慢,在第1、2 天幾乎難以觀察到因子表達,遲至第7 天才觀察到少量神經元內出現GAP43 和BDNF 的表達。

2.2 熒光金逆行示蹤結果

實驗組與對照組動物術側脊髓灰質前角及相應背根神經節中皆觀察到被FG 逆行標記的神經元胞體(圖3),但實驗組與對照組中被FG 標記的神經元數量則未觀察到明顯差別(表1)。

2.3 再生神經形態觀察

2.3.1 再生神經大體觀察

兩組再生神經與近遠側端神經連接良好,連接處無明顯膨大、腫脹,無粘連,表面血管生長清晰可見。

2.3.2 光鏡觀察

兩組中段神經組織橫切面三色染色(髓鞘染成紅色,軸突染成藍綠色)和縱切面抗NF 與S-100 雙重免疫熒光組織化學染色(髓鞘成紅色熒光,軸突為綠色熒光)的切片上皆觀察到發育良好的再生神經組織(圖4、5),有髓神經纖維分布均勻,三色染色片中神經纖維間皆可見少量增生結締組織,兩種染色片中實驗組相對于對照組皆未觀察到明顯優勢,當然與正常神經相比,無論是髓鞘發育程度還是神經纖維密度等皆差異明顯。

2.3.3 電鏡觀察

實驗組與對照組遠端神經電鏡圖片(圖6)上,可見較多的有髓神經纖維,髓鞘結構致密均勻,板層結構清晰,再生神經纖維成簇分布。 形態學統計分析顯示(表1),髓鞘厚度及神經纖維密度兩項指標實驗組雖略高于對照組,但未見明顯組間差別(P值分別為0.767,0.908),軸突直徑和G 比值兩項指標對照組略高于實驗組,但組間差異亦不明顯(P值分別為0.960,0.565)

2.4 腓腸肌形態觀察與計量

2.4.1 腓腸肌大體觀

整個實驗過程中,隨時間的延長,缺損神經對應的靶肌肉萎縮情況逐漸加重。 橋接修復時觀察到兩組動物術側腓腸肌較相應的非手術側均有不同程度的萎縮。 取材時發現,兩組動物術側靶肌肉萎縮明顯,肉眼觀與對照組類似。

2.4.2 相對濕重比

實驗組術側腓腸肌相對濕重比略高于對照組(表1),但組間差異亦不明顯(P=0.760)。

2.4.3 光鏡觀察

在兩組動物實驗側腓腸肌Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組化染色切片上(圖7),皆觀察到一定數量的運動終板,呈類圓形或橢圓形、深棕色,肌纖維橫紋清晰,可見有未著色的運動神經纖維(研究中曾采用鍍銀復染證實其為神經纖維)與運動終板相連。

圖1 神經缺損8 周修復術后不同時間段脊髓橫切面抗GAP43 和BDNF 雙重免疫熒光組織化學染色Note. Staining for GAP43 (A1-F1,green) and BDNF (A2-F2,red) (merged in A3-F3) in the experimental group (A1-A3、C1-C3、E1-E3) or control group(B1-B3、D1-D3、F1-F3) at 1,2, 7 days after repair, respectively. The same as below.Figure 1 Light micrographs following double staining for GAP43 and BDNF on the transversely sectioned spinal cord after repair of the 8-week-delayed defective nerve

3 討論

周圍神經缺損再生是世界性難題,陳舊性周圍神經再生修復更是困難。 由于受傳統理論的影響,特別是在學術界長期占據統治地位的“神經損傷一年以上無修復價值”觀念的影響[1-3],致陳舊性周圍神經缺損是否有修復價值一直存在爭論,另一方面,由于神經再生速度緩慢,再生神經到達靶器官前,肌肉已經發生不可逆性萎縮,特別是對于效應器距離損傷部位較遠的外周神經高位損傷,即便神經再生能夠實現,但再生的神經末梢與萎縮的肌纖維之間也很難重新建立有效的神經-肌接頭,從而使神經再生的效果大打折扣。 這些客觀現實都在一定程度上形成了臨床工作者在面對陳舊性周圍神經缺損治療時的消極心理,甚至放棄積極修復轉而行肌腱轉位或肌腱固定等功能重建手術。

圖2 神經缺損8 周修復術后不同時間段背根節橫切面抗GAP43 和BDNF 雙重免疫熒光組織化學染色Note. A/B, Experimental group. C/D, Control group.Figure 2 Light micrographs following double staining for GAP43 and BDNF on the transversely sectioned DRGs after repair of the 8-week-delayed defective nerve

表1 逆行示蹤、再生神經形態學、腓腸肌相對濕重定量比較(ˉx±s, n=3)Table 1 Quantitative comparison of the retrograde labeling,morphology of regenerative nerve and the relative wet weight of gastrocnemius muscle

圖3 FG 逆行示蹤脊髓(A、C)和背根節(B、D)觀察Note. A/B, Experimental group. C/D, Control group.Figure 3 Light micrographs following FluoroGold retrograde tracing of spinal cord (A, C) and DRGs (B, D)

圖4 橋接物中段橫切面神經三色染色Note. A, Experimental group. B, Control group. C, Normal nerve.A1-C1, Higher magnifications of the boxed areas in A-C.Figure 4 Light micrographs following Meyer’s modified trichrome staining on transversely sectioned mid-portion of the regenerated segment at the operated side

圖5 橋接物中段橫切面抗NF 與S-100 雙重免疫熒光組織化學染色Note. A1-A3,Experimental group. B1-B3, Control group. C1-C3,Normal nerve. A1-C1, Staining for NF. A2-C2, S-100. A3-C3,merged.Figure 5 Light micrographs following double staining for NF and S-100 on the transversely sectioned mid-portion of the regenerated segment

圖6 術側坐骨神經遠端電鏡觀察Note. A, Experimental group. B, Control group. A1, Higher magnifications of the boxed areas in A.Figure 6 Transmission electron micrographs of distal sciatic nerve portion at the operated side

對周圍神經損傷再生過程而言,其難度主要包括:近端神經元再生率低;軸突再生速度慢,再生距離長;遠端再生微環境逐漸退變,難以維持“漫長”的再生時間等[12],對陳舊性神經損傷,遠端靶器官所經歷的長時間等待就更長了。 因此,能促使上述神經再生過程有些許縮短的因素都將對提高陳舊性神經損傷的再生效果提供幫助。

圖7 術側腓腸肌Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組化染色光鏡觀察Note. A, Experimental group. B, Control group. C, Normal nerve.A1-C1, Higher magnifications of the boxed areas in A-C.Figure 7 Light micrographs following Karnovsky-Root cholinesterase staining of the motor endplate on transverse sections of gastrocnemius muscle at the operated side

外周神經損傷后,遠側端的再生微環境對再生軸突的支持作用固然重要,但由于來自遠側端施萬細胞所提供的GDNF、BDNF 等營養因子表達較慢且難以在早期對軸突再生提供有效支持,對陳舊性神經損傷來說,這種支持顯然大為降低,因此來自近端神經元的神經營養因子顯得尤為關鍵,其表達水平與時效性在促進神經再生中發揮著重要作用。

文獻報道顯示低頻電刺激可能是通過激活神經元胞體上的電壓依從性鈣通道(這種短期電刺激對神經再生的作用可被鈉通道阻滯劑TTX 阻斷構成了這一推斷的間接證據),進而激活胞內腺苷酸環化酶/cAMP-依賴性蛋白激酶系統[13-14],促使胞體內cAMP 水平上升,激活下游的PKA、CREB,進而啟動 BDNF、trkB、Tα1-tubulin 及 GAP-43 等系列內源性因子的表達,促進神經軸突早期再生,并幫助再生的軸突通過損傷點進入遠端,縮短整體再生時間[7,15-19]。 上述通過影響近端神經元發揮促神經再生作用的可能機制也被認為是電刺激促神經再生的主要途徑。 本實驗觀察了橋接修復早期動物相應神經元內源性神經因子的表達,觀察到SELS對神經元內源性因子表達的促進作用,與前述文獻報道基本一致。

相關研究發現神經干切斷后1 個月時,近端脊髓前角中神經元數量丟失最多,減至對照側60%,神經元胞體則經歷先腫脹后縮小的變化,至2 ～3 個月左右,神經元胞體形態趨于穩定,以后形態、數量變化不大,直到12 個月[20-21]。 損傷側近端脊髓中神經元的這些形態、數量的變化較大程度上影響了陳舊性神經缺損模型近端神經元對SLES 的響應速度和相關因子的上調水平,從而影響了SLES 對陳舊性損傷的周圍神經再生的促進作用。

Han 等[22]、Xu 等[23]的研究認為電刺激能對延遲修復的陳舊性神經損傷發揮促神經再生作用,但延遲期超過1 個月的神經損傷,電刺激發揮的促神經再生作用則較為有限。 Huang 等[24]最近的研究指出,電刺激可以促進陳舊性神經缺損的神經再生,最長延遲期可達24 周。 這可能與實驗中使用的神經缺損模型不同有關。 本研究所制備的陳舊性周圍神經缺損模型為無自發再生可能的長距離神經缺損(對大鼠而言,＞12 mm 被認為是長距離神經缺損[25-26]),缺損距離長達13 mm, 比Huang 等[24]研究中的 5 mm 神經缺損模型距離長。 Elzinga等[27]使用交叉縫合模型來研究電刺激對陳舊性神經損傷的作用,發現電刺激對延遲達3 個月的陳舊性神經損傷仍然有促進作用。 交叉縫合模型采用的是無缺損的直接端對端吻合,與本研究所用的長距離神經缺損模型相比,神經損傷程度、神經修復和再生的難度皆有較大區別。 但 Huang 等[24]、Elzinga 等[27]的研究是有價值的,顯示了電刺激對陳舊性神經損傷修復的積極作用。

綜上所述,在本研究中,我們雖然在實驗組中觀察到SLES 對神經元相關神經因子表達的一定促進作用,但在神經纖維發育、靶器官再支配和肌肉宏觀相對濕重比等方面,實驗組動物均未表現出明顯優勢。 這些結果表明,SLES 對延遲至8 周修復的陳舊性坐骨神經損傷的積極作用難以抵消延遲時間延長導致殘存神經元再生率下降、遠端再生微環境支持能力減弱、靶肌萎縮等不利因素。 因此,對于陳舊性周圍神經損傷,有必要進一步優化電刺激的方式,比如術中直接刺激與術后的體外刺激相結合,刺激近端神經元與激活遠端再生微環境、保護靶器官相結合,多措并舉,使電刺激更好的發揮對陳舊性周圍神經再生的促進作用。