洛鉑對結腸癌細胞的抗腫瘤活性及機制研究

劉友強,王貴英,2*,胡冀陶,韓佳旭,席金川,李保坤

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外二科,石家莊 050011; 2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院,石家莊 050000)

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,在世界范圍內,結直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第三位,死亡率居第四位[1]。 在我國,結直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢,最新數據顯示,2015 年中國CRC發(fā)病人數為37.63 萬例,死亡人數為19.1 萬例。 在我國男性第五位、女性第四位高發(fā)性惡性腫瘤,位居我國惡性腫瘤死因的第五位[2]。 結直腸癌治療方式為以手術為主,放化療為輔的綜合治療。 雖然近年來針對結直腸癌的預防及臨床治療手段均有明顯改善,但其發(fā)病率和死亡率仍沒有顯著降低趨勢,尤其是Ⅳ期結直腸癌患者的生存率并未見明顯的提升,治療效果仍然不能令人滿意。 晚期結直腸癌嚴重影響患者的生活質量及生存期。

此外,結直腸癌是一種慢性、多基因和非可控性炎癥驅使的惡性腫瘤[3],發(fā)生和發(fā)展機制非常復雜。 因結直腸癌惡性程度較高,腫瘤異質性明顯,對放化療缺乏特異性等特點,導致CRC 對放化療易產生耐受[4]。 因此,尋找新的有效治療靶點,探索新的治療模式,是結腸癌亟待解決的問題。

洛鉑(化學式:C9H18N2O3Pt)是第三代抗腫瘤鉑類制劑,其抗腫瘤活性與DNA 烷基化和干擾cmyc基因相關[5],具有更強的抗腫瘤作用,且副作用更少。 臨床前研究表明,洛鉑可打破某些腫瘤細胞對順鉑或卡鉑的耐藥性[6-7]。 大量臨床試驗已證明洛鉑在多種癌癥中具有抗腫瘤作用,洛鉑能顯著抑制乳腺癌、胃癌、黑色素瘤等癌癥[7-10]的侵襲轉移,抑制腫瘤細胞的增殖,誘導腫瘤細胞凋亡,殺傷對腫瘤細胞。

但洛鉑在結腸癌中的作用和分子機制很少被研究,其作用及機制尚不明確。 在本研究中,初步探討洛鉑對結腸癌細胞的抑制作用,分析洛鉑誘導結腸癌SW480 細胞死亡的類型,并對其作用機制-凋亡相關基因BAD 和BCL-2 表達-進行了探索,為洛鉑在結腸癌患者中的應用提供理論依據。 因此,本研究的目的是探索洛鉑在結腸癌SW480 細胞中的抗腫瘤活性,闡明潛在分子機制,為臨床應用提供理論證據。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

人結腸癌SW480 細胞由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心所提供。

1.2 主要試劑與儀器

10%新生胎牛血清(杭州四季清公司);RPM-1640 干粉培養(yǎng)基(美國GIBCO 公司)。 胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙錠均為山東茂軍化工科技有限公司;GAPDH、BAD、BCL-2、p-BAD、p-AKT、CASPASE-3 抗體及熒光二抗均購自美國Abcam 公司; MK - 206 和 SC79 購 買自美 國Selleckchem 公司;洛鉑購自益佰制藥有限公司。MTT 檢測試劑盒購買自Abcam 中國;流式細胞儀(美國 Attune NxT 公司);檢測細胞凋亡所需的Annexin-V 和 7 -AAD(PI) 購買自百奧萊博;Transwell 小室及克隆形成實驗耗材購自美國Corning 科技。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

人結腸癌SW480 細胞用含10%標準胎牛血清的RPM1640,100 μg/mL 鏈霉素和每毫升100 單位青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng),細胞培養(yǎng)箱設定為37℃、5%CO2,當細胞密度達到80%～90%時,傳代培養(yǎng),每3 d 傳代 1 次。

1.3.2 MTT(四唑鹽)比色法

采用MTT 實檢測洛鉑對結腸癌細胞的抗腫瘤活性。 將SW480 細胞接種在96 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜,然后用不同濃度梯度的洛鉑(0,8,16 和24 μg/mL)與結腸癌 SW480 細胞共培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h,采用OD490nm測量各孔的吸光值。 生成細胞活力曲線。

1.3.3 細胞克隆形成實驗

采用克隆形成實驗檢測洛鉑對結腸癌細胞的抑制作用。 將SW480 細胞在6 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)孵化一夜。 將結腸癌細胞與不同濃度梯度的洛鉑(0,8,16 和 24 μg/mL)共培養(yǎng) 48 h,然后用新鮮的RPMI 1640 培養(yǎng)基替代含有洛鉑的培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)2 周之后,通過固定和染色后,采用光學顯微鏡對細胞克隆數(超過50 個細胞)進行分析。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

采用細胞取對數期結腸癌SW480 細胞,加入濃度梯度為 0、8、16、24 μg/mL 的洛鉑,培養(yǎng) 48 h 后,用不含EDTA 的胰酶消化后,收集細胞。 用預冷1×PBS(4℃)洗滌細胞,加入 100 Ml 1×BindingBuffer重懸細胞。 AnnexinV-FITC 標記細胞后,避光,室溫孵育15 min,上機前5 min 再加入5 μL 的PI 染色進行PI 標記,檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot 檢測凋亡相關蛋白

將結腸癌細胞與不同濃度梯度的洛鉑(0、8、16、24 μg/mL)共培養(yǎng) 48 h,收集細胞,用 PBS 洗滌,裂解提取蛋白,將50 μg 蛋白加入SDS 凝膠中,電泳將蛋白轉運至PVDF 膜上用含有5%脫脂牛奶的TBST 封閉。 一抗 CASPASE-3,BAD,BCL-2,GAPDH(1 ∶1000 稀釋)4℃ 過夜,二抗(1 ∶10000)在 37℃ 下孵育2 h,成像顯影。

1.3.6 探索洛鉑誘導結直腸癌細胞凋亡的機制

MK-206 是一種AKT 抑制劑,SC79 一種新型的AKT 小分子激動劑。 將結腸癌細胞分為4 組,洛鉑0 μg/mL 組,洛鉑 24 μg/mL 組,洛鉑 0 μg/mL+ MK-206 組,洛鉑 24 μg/mL+ SC79 組,共培養(yǎng) 48 h,收集細胞,用PBS 洗滌,裂解提取蛋白,將50 μg 蛋白加入SDS 凝膠中,電泳將蛋白轉運至PVDF 膜上,用含有5%脫脂牛奶的 TBST 封閉。 一抗 pAKT、AKT、p-BAD、BAD、BCL-2、CASPASE-3、GAPDH(1 ∶1000 稀釋)4℃ 過夜,二抗(1 ∶10000)在 37℃下孵育2 h,成像并分析各組蛋白的表達情況,探索洛鉑促凋亡機制。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗結果數據采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件處理,計量資料以平均數±標準差()表示,組間比較采用t檢驗,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 洛鉑抑制結腸癌SW480 細胞增殖

采用MTT 實驗及克隆形成實驗檢測洛鉑對結腸癌SW480 細胞的抑制作用。 為探索洛鉑對細胞增殖活性的抑制作用。 本研究采用不同梯度(0,8,16 和 24 μg/mL)的洛鉑作用 SW480 細胞 24 h、48 h和72 h,之后進行 MTT 分析。 結果表明洛鉑對SW480 細胞增殖活性具有明顯抑制作用,且表現(xiàn)出事件和劑量依賴型。 隨藥物濃度的增加,洛鉑的抑制作用逐漸增強,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 隨著作用時間的增加,洛鉑的抑制作用也逐漸增強,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 其抑制率呈時間-劑量依賴關系。 見表1。

細胞克隆形成結果顯示,洛鉑能抑制結腸癌細胞的克隆形成,抑制細胞增殖,且呈現(xiàn)為劑量依賴型,隨著洛鉑濃度的增加,抑制作用越明顯,結果具有統(tǒng)計學意義。 當洛鉑的藥物濃度為 24 μg/mL時,顯著抑制細胞克隆形成。 見圖1。

2.2 洛鉑誘導SW480 細胞凋亡

本實驗采用流式細胞儀檢測洛鉑對結腸癌SW480 細胞凋亡的影響。 洛鉑作用人結腸癌SW480 細胞48 h 后,研究發(fā)現(xiàn)洛鉑可誘導SW480細胞凋亡,且隨洛鉑濃度的增加,細胞凋亡率明顯增加。 組間比較結果具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結果見圖2。

2.3 洛鉑調節(jié)關鍵凋亡相關蛋白的表達

本研究采用Western blot 法檢測了凋亡相關蛋白CASPASE-3、BAD 與BCL-2 在結腸癌細胞SW480中的表達情況。 結果顯示,洛鉑作用于結腸癌SW480 細胞24 h 后,與對照組相比,隨洛鉑的濃度增加,CASPASE-3 的表達量逐漸上升。 隨洛鉑的濃度增加,BAD 蛋白表達增加,BCL-2 蛋白表達下降,各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),結果見圖3A。 BAD 與BCL-2 的比率顯著提高,結果具有統(tǒng)計學意義。 見圖 3B、3C。

表1 洛鉑對SW480 細胞株的增殖抑制作用( )Table 1 The inhibitory effect of lobaplatin on the proliferation of SW480 cell line

表1 洛鉑對SW480 細胞株的增殖抑制作用( )Table 1 The inhibitory effect of lobaplatin on the proliferation of SW480 cell line

注:相同洛鉑濃度在不同作用時間及在相同作用時間不同洛鉑濃度對細胞增殖的對比。 與24 h 組和48 h 組相比,*P＜0.05。 下同。Note. Compared among different time at same lobaplatin concentration and different lobaplatin concentration at the same time on cell proliferation.Compared with 24 h and 48 h group,*P＜0.05. The same as below.

濃度(μg/mL)Concentration 24 h 48 h 72 h OD570 nm OD570 nm OD570 nm Control 0.857±0.034 1.310±0.045 1.454±0.051 0.611±0.054* 0.561±0.044* 0.612±0.008*16 0.520±0.34* 0.524±0.022* 0.559±0.031*24 0.464±0.009* 0.479±0.052* 0.504±0.053*8

2.4 洛鉑調節(jié)結腸癌細胞凋亡的信號通路

本研究采用AKT 的抑制劑MK-2206 及激動劑SC97 探討洛鉑調節(jié)結腸癌細胞凋亡的信號通路。研究發(fā)現(xiàn)未采用洛鉑處理的結腸癌細胞pAKT 高表達, 抑 凋 亡 基 因p-BAD、 BCL-2 蛋 白 高 表 達,CASPASE3 蛋白未明顯表達,當加入AKT 的抑制劑MK-2206 后,pAKT、p-BAD 和 BCL-2 蛋白表達下調,CASPASE3 蛋白表達升高,促進了細胞凋亡。

圖1 洛鉑抑制結腸癌細胞克隆形成Figure 1 lobaplatin inhibits colon cancer cell clone formation

圖2 不同濃度洛鉑對SW480 細胞凋亡影響Figure 2 Effect of lobaplatin on apoptosis of SW480 cells

采用 24 μg/mL 洛鉑處理結腸癌細胞后,p-BAD、BCL-2 低表達,CASPASE3 蛋白高表達,當聯(lián)合 AKT 激動劑 SC97 處理后,pAKT、p-BAD 和 BCL-2 蛋白表達上調,CASPASE3 蛋白表達下調,抑制了細胞凋亡(見圖4)。

3 討論

鉑類藥物被廣泛用于多種惡性腫瘤的治療中,然而,其嚴重毒副作用限制了其臨床應用[11]。 順鉑是第一代鉑類藥物,對多種實體腫瘤均能產生抗腫瘤療效。 然而,順鉑藥物常伴有劑量限制性腎毒性,胃腸毒性、耳毒性和神經毒性,阻礙了順鉑在臨床應用。 卡鉑是第二代鉑化合物由于其嚴重的神經毒性和耳毒性,骨髓抑制,特別是血小板減少,同樣影響了卡鉑的應用。 洛鉑(lobaplatin)是第三代鉑類衍生物,該復合物中1,2-二氨甲基-環(huán)丁烷為穩(wěn)定配基,乳酸為離去基團。 與前兩代鉑類藥物相比具有明顯優(yōu)勢,穩(wěn)定性好,抗腫瘤活性強,腎毒性輕,胃腸道反應輕,未表現(xiàn)出順鉑的交叉耐藥性[12]。

圖3 洛鉑調節(jié)關鍵凋亡相關蛋白的表達Figure 3 Lobaplatin regulates the expression of key apoptosis related proteins

圖4 洛鉑調節(jié)結腸癌細胞凋亡Figure 4 Lobaplatin regulating apoptosis of colon cancer cells

BAD 蛋白是BCL-2 基因家族的促凋亡成員,其參與啟動細胞凋亡。 其不包含外部線粒體膜和核膜靶向的結構域。 當BAD 被AKT 磷酸化時,它形成 BAD-14-3 蛋白異二聚體,抑制細胞凋亡。BAD 蛋白可通過在線粒體外膜上打孔,允許細胞色素c 逃逸到細胞質中并激活促凋亡的CASPASE 級聯(lián),來啟動細胞凋亡[13]。 抗凋亡BCL-2 蛋白可抑制細胞色素c 通過線粒體孔釋放,并且抑制細胞質CASPASE 級聯(lián)的活化。 既往研究表明活化的AKT可以使BAD 磷酸化,促進細胞存活,否則促進細胞凋亡[14]。

近期臨床前發(fā)現(xiàn)了洛鉑在大多數惡性腫瘤的潛在抗腫瘤機制。 洛鉑可阻止細胞周期進程,誘導腫瘤細胞凋亡,改變蛋白質組,抑制腫瘤的遷移和侵襲,下調細胞周期蛋白D1,CDK4, CDK6,MMP-2,MMP-9 和 BCL-2 的表達,上調p53,BAX,PARP,CASPASE-3,-8,-9 等基因的表達[15-17]。 但在結腸癌中的作用尚不明確,本研究以人結腸癌SW480 細胞為模型,探討其對結腸癌細胞作用。

本實驗結果顯示洛鉑對結腸癌SW480 細胞生長有明顯抑制作用,抑制結腸癌細胞的增殖,表現(xiàn)為時間-劑量依賴型。 同時洛鉑可誘導結腸癌SW480 細胞凋亡,隨著洛鉑濃度的提高,洛鉑促細胞凋亡的強度表現(xiàn)為增強的趨勢,呈現(xiàn)出劑量依賴型。 CASPASE 家族蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)揮著關鍵作用[18]。 本研究結果表明,洛鉑作用人結腸癌SW480 細胞后,可提高結腸癌細胞中CASPASE-3 的表達量, 促進細胞的凋亡, 表明洛鉑可通過CASPASE 信號通路誘導細胞凋亡。 BCL 家族蛋白在調節(jié)CASPASE 信號通路誘導細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。 BAX 和BCL-2 是調控細胞凋亡的主要分子[19-20]。 BAX 可以激活 BCL-xl 和 BAD,促進細胞凋亡的發(fā)生,而BCL-2 可以抑制BAX 的表達,抑制細胞凋亡。 BAD/BCL-2 比值在細胞凋亡中一個重要的決定因素[21-22]。 本研究結果顯示,不同濃度梯度的洛鉑作用人結腸癌SW480 細胞后BCL-2 蛋白表達下調,而 BAD 蛋白表達上升,BCL-2/BAD 比值下降,表明BCL 家族蛋白在洛鉑誘導結腸癌細胞凋亡中起著重要的調控作用。

AKT 信號傳導途徑涉及廣泛的細胞功能,包括細胞存活、增殖、血管生成、細胞代謝和細胞遷移。AKT 的激活導致BCL 家族BCL-2 的抗凋亡蛋白的增加。 BCL-2 是一種抗凋亡蛋白,為位于線粒體外膜,通過阻止線粒體釋放細胞色素c,抑制細胞凋亡。 細胞色素 c 從線粒體向細胞質的轉移是CASPASE-3 活化和細胞凋亡誘導的關鍵步驟[23]。本研究中發(fā)現(xiàn),AKT 抑制劑能顯著抑制BCL-2 蛋白表達,促進BAD 和CASPASE-3 蛋白表達,促進細胞凋亡。 AKT 激動劑能顯著抑制BAD 和CASPASE-3蛋白表達,促進BCL-2 蛋白表達,抑制細胞凋亡。本文研究顯示,洛鉑可能通過AKT/BCL-2/BAD 信號通路發(fā)揮促細胞凋亡作用。 洛鉑可顯著抑制結腸癌的SW480 細胞的增殖,具有劑量和時間依賴性。 洛鉑可能通過AKT/BCL-2/BAD 信號通路發(fā)揮促細胞凋亡作用。 因此,洛鉑可能是一種有效的抗結腸癌藥物,但尚需要進一步的研究和臨床評價。