骨微環境中外泌體內miRNA介導的細胞信號通路研究現狀

藺一凡 張云泉 董 偉

外泌體由Johnstone從綿羊的網織紅細胞中經過離心獲取，其直徑40～150 nm，具有靶向傳遞信息的能力。外泌體是由細胞內部的核內體與細胞膜融合后經胞吐作用釋放的膜性小泡，脂質雙分子層的結構可以保護其內部的蛋白質、小分子RNA(MicroRNA，miRNA)等遺傳物質不被分解和破壞。外泌體廣泛存在于破骨細胞、成骨細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等骨改建主要效應細胞中，通過調控骨效應細胞中關鍵信號分子影響骨改建過程。

外泌體如同信息傳輸器，將其攜帶的各種生物分子傳送至受體細胞中，其介導的遺傳信息傳遞是骨效應細胞間信號交談的重要環節。作為組成外泌體的重要內容物質， miRNA是其重要生物活性成分，miRNA以非編碼RNA的結構，經由外泌體轉運至受體細胞，與靶基因互補配對，從而調控下游靶基因表達。研究證實，miRNA可通過調控下游靶基因對骨效應細胞的分化及功能產生影響，在骨改建中發揮重要的調控作用。因此，本文對骨效應相關細胞外泌體內miRNA介導的信號通路作用進行了綜述。

1 成骨細胞外泌體中miRNA調控機制

成骨細胞來源的外泌體內含有多種miRNA，其中 miR-let-7、miR-140-3p、miR-503-3p、miR-30d-5p、miR-218、miR-335-5p分別發揮著促進或抑制成骨分化的作用，對于骨改建的過程具有重要意義(見圖1)。作為骨骼發育的正向調節因子，miR-let-7在成骨細胞及其前體細胞產生的外泌體中表達上調，通過靶向作用于高遷移率蛋白A2 (high-mobility group AT-hook 2，HMGA2)，促進間充質干細胞(stromal mesenchymal stem cells, MSCs)異位成骨，抑制其成脂能力。成骨細胞外泌體中高表達的miR-140-3p可直接抑制骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)；若對人骨髓間充質干細胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)中miR-140-3p進行阻斷，可促進骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)信號元件和成骨分化關鍵調控因子的表達。miR-503-3p被證實在成骨細胞外泌體中存在，通過調節核因子-κB受體激活劑(receptor activator for nuclear factor-κB, RANK)的表達抑制破骨細胞的分化，為骨質疏松的治療提供了新思路。

圖1 骨效應細胞外泌體miRNA信號調控通路示意圖

研究表明，來源于成骨細胞外泌體的miR-30d-5p靶向作用于runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)基因，并下調成骨細胞Runx2蛋白的表達，抑制成骨細胞分化。miR-218被證實具有強大的成骨特性，通過下調成骨過程中3種Wnt信號抑制劑[骨硬化蛋白 (sclerostin，SOST)、DKK2、分泌型卷曲相關蛋白2(secreted frizzled-related protein2，SFRP2)]蛋白表達水平，激活Wnt信號通路，促進骨髓基質細胞分化、增強成骨細胞表型和成骨細胞相關腫瘤活性。體外研究發現， miR-335-5p降低了DKK1 (dickkopf-related protein 1)水平，激活Wnt/ β-catenin信號通路,促進了Wnt信號傳導和糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β)磷酸化，β-catenin轉錄活性增強，促進成骨分化。此外，Cui等研究證實，礦化成骨細胞(mineralizing osteoblasts, MOBs)來源的外泌體內miRNAs(miR-667-3p、miR-6769b-5p、miR-7044- 5p、miR-7668-3p和miR-874-3p)通過抑制軸蛋白1(axis inhibition protein 1，Axin1)表達、促進β-catenin表達，激活Wnt信號通路促進骨髓基質細胞(ST2細胞)成骨分化及基質礦化能力。

2 破骨細胞外泌體中miRNA調控機制

破骨細胞外泌體內存在著許多具有調控功能的miRNA，通過不同的細胞信號通路在骨微環境中發揮著重要作用(見圖1)。研究證實，miR-378在破骨細胞外泌體中表達量最高；miR-378通過靶向抑制SuFu和Fus-1基因，促進破骨細胞周圍細胞存活和血管形成。Yosuke 等發現，miR-210通過靶向結合AcvR1b基因，抑制轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/激活素(activin)信號通路，實現對小鼠間充質細胞成骨分化的正向調節。另有研究發現，miR-23a-5p在骨改建過程中發揮重要作用，破骨細胞來源的外泌體miR-23a-5p通過抑制Runx2基因表達同時上調YAP1介導的金屬硫蛋白1D假基因(metallothionein 1D pseudogene，MT1DP)基因表達，發揮對成骨細胞分化的抑制作用。

作為破骨細胞與成骨細胞信號交流的信使，miR-214在骨微環境細胞信號通路中發揮了重要調控作用。破骨細胞外泌體內miR-214-3p的增加與血清中miR-214-3p的升高及骨形成減少密切相關，破骨細胞外泌體通過ephrinA2/EphA2被成骨細胞識別攝入，外泌體內miR-214-3p靶向作用于成骨細胞受體 (activating transcription factor 4，ATF4)，抑制成骨細胞活性，減少體內骨形成。成骨特異性相關轉錄因子抗體Osterix對骨形成具有重要作用，miR-214-3p通過靶向作用于Osterix,參與抑制小鼠成肌細胞(C2C12細胞)的成骨分化過程。在巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和RANKL誘導破骨細胞的形成過程中，miR-214-3p通過PI3K/Akt信號通路靶向作用于同源性磷酸酶(phosphatase and tensin homolog，Pten)，促進破骨細胞的增殖。上述研究結果提示，破骨細胞外泌體中的miR-214可作為潛在干預靶點，在骨代謝類疾病的治療中發揮重要作用。

3 間充質干細胞外泌體中miRNA調控機制

大量研究證實，間充質干細胞外泌體內的miRNA通過多種信號通路對骨微環境中效應細胞產生不同的調節作用(見圖1)。間充質干細胞來源外泌體miR-181a通過抑制TGF-β信號分子，靶向作用于成骨分化的負調控因子Tgfbi和TβR-I/Alk5，促進成骨細胞分化。Qin等通過體外研究發現，人骨髓間充質干細胞(human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)來源外泌體與成骨細胞融合，被轉移至高爾基體并釋放其內容物，外泌體中miR-196a通過上調成骨基因ALP、骨鈣素 (osteocalcin，OCN)、 骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和Runx2的表達促進成骨細胞的分化；同期體內實驗建立SD大鼠顱骨臨界骨缺損動物模型，證實hBMSCs來源的外泌體具有較強的體外成骨潛能。

轉化蛋白1(specificity protein 1，Sp1)是轉錄因子家族一員，可調節細胞凋亡和增殖，被認為是軟骨細胞增殖的抑制劑。研究發現，TGF-β1作用于間充質干細胞來源外泌體中miR-135b，下調軟骨細胞內Sp1表達，促進軟骨細胞的增殖，提高骨關節炎(osteoarthritis, OA)軟骨修復作用。滑膜間充質干細胞(synovial mesenchymal stem cells, SMSCs)來源的外泌體可促進軟骨細胞的增殖和遷移。Tao等發現，OA大鼠模型中，對miR-140-5p進行過表達，可通過作用于小GTpase的Ras超家族成員 RalA，阻斷Wnt信號通路，激活轉錄共激活因子相關蛋白(yes-associated protein，YAP),阻止OA的發生并促進軟骨組織的再生。研究證實，骨質疏松癥患者BMSc來源的外泌體miR-21，通過與成骨分化調控基因SMAD7靶向結合，對骨形成產生抑制作用。miR-31a-5p以BMSCs產生的外泌體作為載體，激活SATB2通路，抑制E2F2的轉錄功能，抑制老年大鼠BMSCs礦物質的沉積，促進破骨細胞分化生成。Sun等發現，成骨負調控因子Smurf1是miR-503的作用靶點，在大鼠BMSCs成骨過程中miR-503表達的升高抑制Smurf1表達，加速了成骨過程。

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head, ONFH)是骨骼系統的常見疾病，對MSCs來源的外泌體中miRNA進行干預，可能為該疾病的治療提供新的研究方向。XU等針對BMSC外泌體miR-122-5p在ONFH的作用進行了體內外研究，體外研究發現，BMSCs外泌體中miR-122-5p激活受體酶氧酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)/Ras/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，下調SPRY2表達，促進成骨細胞的增殖和分化；體內實驗同樣證實了其促進成骨的作用，該研究提示miR-122-5p可作為ONFH治療的新靶點。除miR-122-5p外， miR-224-3p在外傷性股骨頭壞死的發生中也具有重要意義，外傷性股骨頭壞死中，miR-224-3p的下降促進內皮細胞的增殖、遷移和血管生成，上調其靶基因FIP200表達，過表達的FIP200同樣可促進骨組織周圍血管形成，最終促進成骨分化。

4 結語

近年來，隨著各專業領域對外泌體的深入研究，外泌體對骨微環境調控作用日趨受到重視。外泌體對骨微環境調控主要通過其攜帶的蛋白質、核酸和miRAN來實現，其中miRNA在骨改建中建立了一種全新的細胞間信號傳導系統，骨效應細胞以外泌體中miRNA為信息載體物質，通過miRNA對下游信號通路的靶向作用實現細胞間的信號“交談”。本文通過對外泌體中miRNA介導骨效應細胞間的信號通路進行綜述，旨在為外泌體對骨組織相關疾病的診斷、治療提供了理論基礎。目前，外泌體并未大規模應用于臨床中，仍存在許多問題待進一步探究。有理由認為，隨著研究的不斷深入，將會揭示出更多外泌體中miRNA調控骨微環境的信號通路，為醫學發展及臨床疾病的診療研究提供理論支持。