多指標綜合評分法正交試驗優選蜜炙鮮百合的炮制工藝

侯敏娜，李 丹，劉艷紅，彭修娟，陶星茹

(1.陜西國際商貿學院 醫藥學院，陜西 咸陽 712046；2. 西安外事學院 醫學院， 陜西 西安 710077)

百合，是百合科百合屬(Lilium)植物卷丹的干燥肉質鱗葉[1]，其味甘、性寒，歸心、肺二經，具有藥食同源的本領[2,3]。百合中主要含有酚酸甘油酯、皂苷、生物堿及多糖等多種活性成分[4]。現代藥理研究表明，百合具有止咳、祛痰、清心安神、調節免疫、抗腫瘤和抗氧化等作用[5～7]。

現行版《中國藥典》中蜜炙百合的炮制方法無明確的工藝參數，缺乏客觀、量化的指標，故本研究以浸膏重量和百合皂苷得率的綜合評價為指標，考察炒藥溫度、加蜜量、炒藥時間等因素，設計正交試驗以確定其炮制工藝各參數。這為蜜炙鮮百合飲片的深加工提供理論參考依據，同時對于臨床用藥具有重要的理論和實際意義。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

鮮百合(購于甘肅蘭州，經我院中藥學教研室雷國蓮教授鑒定為Lilium)、薯蕷皂苷標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：2014041)、蜂蜜(冠生園牌，上海冠生園蜂制品有限公司)、高氯酸(天津市盛奧化學試劑有限公司)、甲醇(天津化學試劑有限公司)等，試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ5200DE型超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)、SHZ-3型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、TCL-62B型臺式離心機(長沙恒諾儀器設備公司)、TU-1810型紫外分光光度計(上海長城制造有限公司)、BS224S型電子分析天平(賽多利斯儀器有限公司)、HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)等。

2 方法

2.1 煉蜜

百合藥材富含淀粉有一定黏性，且質地致密，生蜜不易被吸收，故選擇嫩蜜。即將生蜜加熱煮沸，直到溫度達到105～115 ℃，過濾去沫，即可。

2.2 試驗方法

2.2.1 蜜炙百合的炮制方法 準確稱取經曬干、切片后的鮮百合藥材40 g，倒入預先預熱好的炒鍋中，翻炒，待百合切片中水分蒸發至其表面顏色稍微加深，用手掰之干脆，加入定量嫩蜜，在一定溫度下，翻炒數分鐘，至表面呈黃棕色，偶見黃焦斑，摸之不粘手，傾出，攤涼，即可。

2.2.2 對照品溶液配制 準確稱取2.1500 mg薯蕷皂苷對準品，加甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中。即可得到濃度為0.2150 mg·mL-1的薯蕷皂苷對照品溶液，密閉保存，備用。

2.2.3 樣品溶液制備 稱取蜜炙后的百合10 g置于燒杯中，加60 mL蒸餾水，超聲提取3次，合并提取液，濃縮至20 mL，放涼，加入100 mL乙醇，靜置24 h。抽濾、離心，可得沉淀和上清液。將沉淀于恒溫干燥箱中干燥，稱重。精密移取5 mL上清液于50 mL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，密閉保存，備用。

2.2.4 測定波長的選擇 精密移取“2.2.2”中對照品溶液1 mL，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，高氯酸0.7 mL，搖勻后，在60 ℃水浴中反應20 min，取出，放涼。加入冰醋酸8 mL，搖勻。在紫外波長為200～800 nm范圍內掃描，發現波長在535 nm處為最大吸收。因此，選擇535 nm作為百合皂苷的檢測波長。

2.2.5 驗證性試驗 主要有:

(1)精密度試驗

設定波長為535 nm，連續測定5次吸光度值的對照品溶液及空白溶液。計算可得RSD值為0.27%，表明儀器精密度良好。

(2)穩定性試驗

移取“2.2.3”項下制備的樣品溶液1 mL于試管中，在0～5 h內，每隔1 h，照“2.2.4”中顯色體系的參數及方法處理后，在波長535 nm處測百合皂苷A值，經計算得RSD值為0.10 %，表明供試品溶液穩定性良好。

(3)重復性試驗

照“2.2.3”法制備5份樣品溶液，分別移取1 mL，照“2.2.4”中顯色體系的參數及方法處理后，測定0～5 h內的各A值，計算得到RSD值為0.20 %，表明了本法重復性良好。

(4)加樣回收率試驗

稱取6份百合粉末各0.5 g，按“2.2.3”法制備樣品溶液，移取1 mL于25 mL容量瓶，加入0.25 mg薯蕷皂苷標準品溶液，照“2.2.4”中顯色體系的參數及方法處理后，測定0～5 h內的A值，計算加樣回收率，計算得RSD值為1.42 %，說明了本法加樣回收率良好。

2.2.6 標準曲線的繪制 取6支試管，分別移入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對照品溶液，按“2.2.4”中顯色體系的參數及方法處理后，測定A值。以薯蕷皂苷的濃度(C)為橫坐標(x)，吸光度(A)為縱坐標(y)，繪制標準曲線。可得標準曲線方程為y=0.0167 x +0.255，R2=0.9957，在0.048～0.162 mg·mL-1范圍內，濃度跟吸光度呈良好的線性關系。

2.2.7 樣品溶液的測定 移取1 mL樣品溶液于試管中，照“2.2.3”中顯色體系的參數及方法處理后，于535 nm下測定吸光度值，根據標準曲線，代入公式得到百合皂苷濃度，計算可得百合皂苷得率。

2.2.8 百合皂苷得率及綜合評分計算 根據吸光度值，計算百合皂苷濃度，以浸膏重量和百合皂苷得率進行綜合性評分[8～13]。公式如下：

百合皂苷的得率(%)=C×D×V/M×100 %

其中，C為皂苷濃度，單位為mg·mL-1；D為稀釋倍數；V為體積，單位為mL；M為稱取藥材質量，單位為g。

綜合評分(Y)= (浸膏重量×0.5 /浸膏重量最大值+皂苷得率×0.5 /皂苷得率最大值) × 100

3 結果與分析

3.1 單因素選取

選擇可能影響綜合評分高低的炒藥溫度(60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃)；加蜜量(4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL、24 mL)；炒藥時間(3 min、6 min、9 min、12 min、15 min、18 min)3個因素進行試驗，以確定相關因素及各因素的適應范圍，研究這3個因素對綜合評分的影響[14～17]。

3.2 綜合評分的影響因素水平篩選結果

3.2.1 炒藥溫度對綜合評分的影響 在百合加蜜量為8 mL，炒藥時間為9 min的前提下，將炒藥溫度設置為6個水平，分別為60 ℃、80℃、100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃。在此條件下考察炒藥溫度對綜合評分高低的影響。結果見圖1。

圖1 炒藥溫度對綜合評分的影響

由圖1可看出，當炒藥溫度為120 ℃時，綜合評分達最高。當炒藥溫度小于120 ℃時，綜合評分呈上升趨勢；當炒藥溫度大于120 ℃時，綜合評分明顯呈降低趨勢。可能是由于溫度越高，百合藥材越接近炭化，使得浸膏重量和皂苷得率有所下降，以致其綜合評分下降。因此，炒藥溫度選擇為120 ℃時，百合蜜炙效果最佳。

3.2.2 加蜜量對綜合評分的影響 在百合炒藥溫度為120 ℃，炒藥時間為9 min的前提下，將加蜜量設置為6個水平，分別為4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL、24 mL。在此條件下考察加蜜量對綜合評分高低的影響。結果見圖2。

圖2 加蜜量對綜合評分的影響

由圖2可以看出，當加蜜量為16 mL時，綜合評分達最高。當加蜜量小于16 mL時，綜合評分呈明顯上升趨勢；當加蜜量大于16 mL時，綜合評分略顯降低趨勢。可能是由于加蜜量越高時，藥材不能完全、均勻的吸收，且阻止了皂苷的溶出，以致其綜合評分下降。因此，加蜜量選擇為16 mL時，百合蜜炙效果最佳。

3.2.3 炒藥時間對綜合評分的影響 在百合炒藥溫度為120 ℃，加蜜量為16 mL的前提下，將炒藥時間設置為6個水平，分別為3 min、6 min、9 min、12 min、15 min、18 min。在此條件下考察炒藥時間對綜合評分高低的影響。結果見圖3。

圖3 炒藥時間對綜合評分的影響

由圖3可以看出，當炒藥時間為12 min時，綜合評分達最高。當炒藥時間小于12 min時，綜合評分因受炒藥時間的影響較大，呈顯著的上升趨勢；當炒藥時間大于12 min時，綜合評分呈緩慢下降趨勢。可能是由于炒藥時間越長時，百合藥材內的成分因高溫發生了變化，使得浸膏重量和皂苷得率有所下降，以致其綜合評分下降。因此，炒藥時間選擇為12 min時，百合蜜炙效果最佳。

3.3 正交試驗法優化蜜炙百合炮制工藝條件的確定

3.3.1 正交設計分析因素水平的選取及實驗設計 根據單因素的實驗結果，綜合考慮炒藥溫度、加蜜量、炒藥時間三個自變量對綜合評分存在顯著影響，以A、B和C分別表示炒藥溫度、加蜜量及炒藥時間，各自的不同水平分別以1、2和3表示，設計三因素三水平的9組正交試驗。結果見表1。

表1 蜜炙百合的炮制工藝正交試驗因素水平

3.3.2 正交試驗數據分析結果 由表2，表3正交實驗結果分析可知，炒藥溫度對綜合評分的影響最為顯著。其他因素的影響不顯著，三個因素對綜合評分的影響程度為炒藥溫度(A) >炒藥時間(B)>加蜜量(C)，A因素各水平對實驗結果的影響大小依次為A2>A1>A3，A2對其影響最大，B因素各水平對實驗結果的影響大小依次為B2>B3>B1，B2對其影響最大，C因素各水平對實驗結果的影響大小依次為C1>C2>C3，C2對其影響最大， 由此得到最佳的百合蜜炙工藝為A2B2C1，即炒藥溫度為120 ℃，炒藥時間為9 min，加蜜量為16 mL。

表2 數據直觀分析

表3 方差分析

3.3.3 工藝驗證 按照上述所得的最佳炮制工藝進行三次驗證實驗。由驗證結果可知，按最佳炮制工藝蜜炙的百合浸膏重量為0.7058 g， 百合皂苷得率為1.62 %，計算綜合評分為85.06，計算得RSD均小于5 %，說明此蜜炙工藝條件穩定可行。結果見表4。

表4 工藝驗證試驗

4 討論

試驗是對蜜炙鮮百合的炮制工藝進行的優選。由于大量文獻資料和現行版《中國藥典》未對蜜炙藥材的煉蜜程度進行明確的說明，故本研究首先根據百合藥材富含淀粉且質地比較致密、有一定黏性的特征，選擇了嫩蜜。即將生蜜加熱煮沸，直到溫度達到105～115 ℃，過濾去沫；其次，以薯蕷皂苷為對照，以百合皂苷得率和浸膏重量的綜合評價為指標，通過對可能影響蜜炙百合炮制工藝的炒藥溫度、加蜜量和炒藥時間的三個單因素的考察，正交試驗分析結果發現這三個因素對其影響大小順序為炒藥溫度 >炒藥時間>加蜜量；最終優選的工藝為：炒藥溫度120 ℃，炒藥時間9 min，加蜜量16 mL；此時百合浸膏重量為0.7058 g，百合皂苷得率為1.62 %，綜合評分為85.06，RSD均小于5%。

5 結論

研究通過單因素試驗與正交試驗相結合的方式優選出了蜜炙鮮百合的炮制工藝。其炮制品，表面呈深黃色，偶有焦斑；用手摸之，略有黏性，但不黏手，并具有輔料蜜的香氣，味甜，符合蜜炙炮制品的特征。說明本法可行，可用于鮮百合的蜜炙。這為鮮百合藥材的深加工及臨床應用提供理論依據，也為蜜炙其他類中藥材提供實驗基礎。