模擬失重對(duì)大鼠聽(tīng)功能及耳蝸帶狀突觸的影響

李元超,吳 瑋,3*,王 剛,屈昌北,王 磊,李保衛(wèi),韓浩倫,李 丹,劉 鋼

(1北京大學(xué)解放軍306醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院耳鼻咽喉科,北京 100101;2中國(guó)人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉科;3國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境感官應(yīng)激與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;*通訊作者,E-mail:ent306ww@126.com;#共同通訊作者,E-mail:wanggang306yy@126.com)

內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸(ribbon synapses,RS),即內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cell,IHC)與Ⅰ型螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons,SGNs)形成的突觸,因前膜活化區(qū)內(nèi)錨定有含C末端結(jié)合蛋白2(C-terminal binding protein 2,CtBP2)的特定結(jié)構(gòu)——帶狀體得名,每個(gè)IHC可通過(guò)帶狀體與多個(gè)SGNs形成RS,由其負(fù)責(zé)完成聲信號(hào)的機(jī)械-電換能過(guò)程并向中樞方向傳導(dǎo),對(duì)聲音的編碼具有決定性作用[1]。RS對(duì)多種理化因素都非常敏感,易受噪聲、耳毒性藥物以及衰老等影響發(fā)生損傷且難以恢復(fù)[2]。失重可導(dǎo)致航天性聽(tīng)損傷,表現(xiàn)為聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)閾值暫時(shí)性、甚至永久性閾移,嚴(yán)重時(shí)可增加宇航員執(zhí)行任務(wù)的失敗風(fēng)險(xiǎn)、縮短職業(yè)壽命[3,4]。有學(xué)者在模擬失重大鼠海馬組織中觀察到突觸活動(dòng)區(qū)范圍明顯減少[5]。但耳蝸RS是否會(huì)受到失重影響而發(fā)生改變尚不明確。因此,本研究通過(guò)觀察模擬失重后大鼠聽(tīng)功能及突觸帶狀體數(shù)量的變化,探討失重對(duì)聽(tīng)覺(jué)器官的損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

48只8周齡雄性SD大鼠(購(gòu)自斯貝福公司)隨機(jī)均分為模擬失重組和空白對(duì)照組,每組24只;再依據(jù)暴露時(shí)間隨機(jī)分為1周、4周組,每組12只24耳。模擬失重組大鼠暴露期間始終保持模擬失重狀態(tài);空白對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。在暴露前(B0)、暴露結(jié)束后即刻(P0)和脫離暴露環(huán)境7 d(P7)進(jìn)行雙耳ABR閾值和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)檢測(cè),并在P0和P7測(cè)聽(tīng)結(jié)束后分別處死每組6只大鼠,再解剖分離雙側(cè)耳蝸。P7時(shí)各組測(cè)聽(tīng)耳數(shù)減半,為12耳。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均無(wú)噪聲及耳毒性藥物接觸史,雙側(cè)耳廓、外耳道及鼓膜未見(jiàn)異常。

1.2 模擬失重方法

采用經(jīng)典的頭低位模擬失重法(Morey Holton法)[6]:大鼠頭低位、前肢承受部分重量,后肢離地,身體縱軸與水平面成-30°。懸吊期間大鼠可以自由進(jìn)食水,頭部可自由活動(dòng)。

1.3 聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)

1.3.1 ABR閾值檢測(cè) 分別于B0、P0、P7時(shí),采用10%水合氯醛溶液4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,置于37 ℃恒溫電熱毯上,使用聽(tīng)性腦干反應(yīng)儀(ICS Chartr EP,Medsen)在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)檢測(cè)雙耳ABR閾值。刺激聲為短聲(click),強(qiáng)度為80-5 dB連續(xù)測(cè)定,衰減間隔10 dB,接近閾值時(shí)改為5 dB,以可以重復(fù)的Ⅲ波的最低強(qiáng)度為閾值。

1.3.2 DPOAE檢測(cè) 選擇初始純音的頻率f1和f2,頻率比f(wàn)2/f1=1.21;初始音強(qiáng)度L1和L2,強(qiáng)度差L1-L2=10 dB聲壓級(jí)(sound pressure level,SPL)。以兩個(gè)初始音頻率的幾何均數(shù)f0為測(cè)試頻率,疊加1 024次,取2f1-f2處聲信號(hào)幅值與本底噪聲差值>6為DPOAE引出,選擇f0分別為2,4,8 kHz,測(cè)試耳在所有測(cè)試頻率上的DPOAE全部引出時(shí)方可記為DPOAE通過(guò)。

1.4 RS免疫熒光染色檢測(cè)

分離的耳蝸采用4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣處理后,在解剖顯微鏡下剝離基底膜。于10%山羊血清37 ℃封閉后,采用兔CtBP2抗體(Abcam公司,稀釋比例1 ∶400)4 ℃孵育過(guò)夜,山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司,稀釋比例1 ∶400)室溫孵育1 h;DAPI染色,在體視顯微鏡下鋪片,抗熒光猝滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS-SP8)下觀察并對(duì)突觸帶狀體進(jìn)行計(jì)數(shù),評(píng)估RS損傷情況。

1.5 耳蝸RS計(jì)數(shù)

參考Viberg的方法,在計(jì)數(shù)時(shí)以頂回為0%,底回為100%,整個(gè)基底膜從頂回至底回分段計(jì)數(shù),按照距頂端平均距離共取10個(gè)計(jì)數(shù)段。每個(gè)計(jì)數(shù)段用40倍(oil)物鏡拍攝,然后在其中選取邊長(zhǎng)145 μm的正方形為計(jì)數(shù)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)13-18個(gè)相連的IHC細(xì)胞核及RS數(shù)量,最后依據(jù)整個(gè)基底膜樣本觀察到的突觸總數(shù)和IHC總數(shù)計(jì)算整個(gè)基底膜上平均每個(gè)IHC的帶狀體數(shù)量(個(gè)/IHC)[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組在B0、P0、P7時(shí)的ABR閾值見(jiàn)表1。B0時(shí)空白對(duì)照1周組、模擬失重1周組、空白對(duì)照4周組和模擬失重4周組間ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;空白對(duì)照1周組和空白對(duì)照4周組內(nèi)在B0、P0、P7時(shí)ABR閾值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模擬失重1周和模擬失重4周組在P0時(shí)的ABR閾值較B0時(shí)顯著升高(P=0.001,P<0.001),且模擬失重4周組ABR閾值高于模擬失重1周組(P=0.001)。模擬失重1周和4周組大鼠在P7時(shí)的ABR閾值較B0時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.833,0.955)。

表1 各組暴露前(B0)、暴露結(jié)束后即刻(P0)及脫離暴露環(huán)境7 d(P7)ABR閾值

2.2 DPOAE結(jié)果

各組間大鼠在B0、P0和P7時(shí)的DPOAE引出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

表2 各組暴露前(B0)、暴露結(jié)束后即刻(P0)及脫離暴露環(huán)境7 d(P7)DPOAE引出情況

2.3 免疫熒光結(jié)果

模擬失重后大鼠耳蝸IHC細(xì)胞核移位、排列散亂,至P7時(shí)有所恢復(fù)(見(jiàn)圖1)。各組大鼠突觸計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。模擬失重1周組在P0時(shí)帶狀體數(shù)量較空白對(duì)照1周組下降53.23%,到P7時(shí)該組帶狀體數(shù)量仍比空白對(duì)照1周組低31.61%;而模擬失重4周組在P0時(shí)的帶狀體數(shù)量較空白對(duì)照4周組下降了61.19%,到P7時(shí)該組的帶狀體數(shù)量比空白對(duì)照4周組低39.12%。空白對(duì)照1周組在P0和P7時(shí)的帶狀體數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074);空白對(duì)照4周組在P0和P7時(shí)的帶狀體數(shù)量差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.295)。在P0時(shí),模擬失重1周組較空白對(duì)照1周組、模擬失重4周組較空白對(duì)照4周組的突觸帶狀體數(shù)量均明顯減少(P<0.001),且模擬失重4周組大鼠P0時(shí)突觸帶狀體數(shù)量減少較失重1周組更明顯(P<0.001);模擬失重1周組和模擬失重4周組在P7時(shí)突觸帶狀體數(shù)量均較P0時(shí)數(shù)量增多,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),但仍分別低于空白對(duì)照1周組和空白對(duì)照4周組(P<0.001),且模擬失重4周組低于模擬失重1周組(P<0.001)。

白色短箭頭所示為IHC細(xì)胞核,白色長(zhǎng)箭頭表示CtBP2標(biāo)記的突觸帶狀體,黃色長(zhǎng)箭頭表示移位的IHC細(xì)胞核圖1 各組大鼠免疫熒光染色結(jié)果Figure 1 Immunofluorescence staining results of rats in each group

表3 各實(shí)驗(yàn)組P0、P7內(nèi)毛細(xì)胞突觸帶狀體計(jì)數(shù)

2.4 帶狀體數(shù)與ABR閾值相關(guān)性分析

對(duì)大鼠RS帶狀體數(shù)量與ABR閾值進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示RS帶狀體數(shù)量與ABR閾值負(fù)相關(guān)(r=-0.759,P=0.029,見(jiàn)圖2)。失重組大鼠ABR閾值在暴露結(jié)束后即刻最高,脫離暴露環(huán)境7 d后恢復(fù)至暴露前水平,而突觸帶狀體數(shù)量在暴露結(jié)束后即刻到達(dá)最低水平,脫離暴露環(huán)境7 d后部分恢復(fù)。

圖2 突觸帶狀體數(shù)量與ABR閾值相關(guān)性分析結(jié)果Figure 2 Correlation analysis between RS ribbon count and ABR threshold

3 討論

天宮二號(hào)在軌飛行30 d任務(wù)圓滿完成標(biāo)志著中國(guó)人在太空的駐留時(shí)間記錄刷新,較長(zhǎng)時(shí)間太空飛行潛在的健康問(wèn)題也受到更多關(guān)注。既往研究[8,9]表明模擬失重可引發(fā)聽(tīng)覺(jué)損傷,表現(xiàn)為ABR閾值升高;而損傷機(jī)制的研究主要集中于耳蝸毛細(xì)胞纖毛紊亂、凋亡和缺失等形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變。本研究中模擬失重4周內(nèi)大鼠ABR閾值隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而提高,且耳蝸IHC表現(xiàn)為核移位、排列散亂,但這些變化均可逆。在以上可逆性損傷之外是否存在聽(tīng)覺(jué)傳入通路上其他敏感部位的損傷,是本研究重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容。

耳蝸RS因前膜活化區(qū)內(nèi)錨定有含CtBP2的帶狀體得名。含神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的突觸囊泡大量栓系在帶狀體表面,突觸后膜上表達(dá)相應(yīng)受體[1]。外界聲音信號(hào)經(jīng)過(guò)機(jī)械-電轉(zhuǎn)化使突觸前膜發(fā)生去極化,引起活化區(qū)CaV1.3L型鈣通道開(kāi)放、Ca2+內(nèi)流觸發(fā)谷氨酸釋放,作用于突觸后膜上的受體,引起突觸后膜去極化,聲信號(hào)開(kāi)始在聽(tīng)神經(jīng)上傳導(dǎo)[10]。任何導(dǎo)致RS病變的因素均可造成其后的聽(tīng)神經(jīng)纖維無(wú)法興奮,損傷聽(tīng)功能。自Liberman等[11]提出噪聲暴露原發(fā)性損傷耳蝸RS,而毛細(xì)胞缺失和SGNs退行性改變繼發(fā)于RS損傷的觀點(diǎn)以來(lái),越來(lái)越多的研究[12-14]表明RS是聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中對(duì)各種理化因素作用非常敏感的部位,其損傷或丟失常早于內(nèi)、外毛細(xì)胞的損傷。鄧子宣等[5]研究表明模擬失重2周大鼠CA1海馬神經(jīng)元的突觸間隙和神經(jīng)元活動(dòng)區(qū)長(zhǎng)度顯著減少;王婷梅等[15]在尾吊4周大鼠的海馬組織中發(fā)現(xiàn)突觸后膜興奮性離子型谷氨酸受體的表達(dá)明顯下調(diào)。這些研究均表明失重對(duì)神經(jīng)中樞突觸造成損傷,而失重環(huán)境對(duì)耳蝸RS是否產(chǎn)生損傷及具體損傷表現(xiàn)缺乏報(bào)道。

本研究使用免疫熒光染色法,以CtBP2抗體標(biāo)記耳蝸突觸帶狀體并進(jìn)行計(jì)數(shù),評(píng)估模擬失重后的帶狀突觸損傷。結(jié)果表明模擬失重可導(dǎo)致RS數(shù)量減少:模擬失重1周組突觸帶狀體數(shù)量較空白對(duì)照組下降53.23%,模擬失重4周組帶狀體數(shù)量進(jìn)一步減少,較空白對(duì)照組下降61.19%。目前認(rèn)為各種理化因素?fù)p傷RS的機(jī)制可能有內(nèi)耳缺血、活性氧、自由基損傷以及突觸后Ca2+超載等[2,16]。模擬失重導(dǎo)致RS數(shù)量減少可能的機(jī)制主要有兩方面;一方面,失重引起的體液頭向分布可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、內(nèi)耳淋巴液容積增大[17],到達(dá)一定程度后血流減少,影響氧供和代謝,打破機(jī)體正常的氧化與抗氧化的平衡體系[18],在內(nèi)耳可表現(xiàn)為大量的氧自由基蓄積造成損傷;另一方面,失重也會(huì)引起機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞Ca2+濃度變化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,鈣信號(hào)異常[19,20]。而耳蝸IHC的L型鈣離子通道(CaV1.3)和Ca2+穩(wěn)態(tài)對(duì)IHC發(fā)育和RS突觸前膜的活躍必不可少,內(nèi)毛細(xì)胞RS突觸前膜CaV1.3開(kāi)放、Ca2+內(nèi)流是誘發(fā)突觸囊泡與細(xì)胞膜融合、神經(jīng)遞質(zhì)Glu釋放的關(guān)鍵步驟[10]。若失重狀態(tài)下IHC內(nèi)的Ca2+濃度以及Ca2+通道電流改變,也可能導(dǎo)致RS數(shù)量變化。

脫離暴露環(huán)境7 d后突觸帶狀體計(jì)數(shù)顯示,模擬失重1周組和模擬失重4周組的帶狀體數(shù)量在P7時(shí)均有所恢復(fù),但仍與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示模擬失重4周內(nèi)可能已對(duì)RS造成了部分不可逆損傷。目前關(guān)于帶狀突觸損傷的研究結(jié)果因暴露條件和研究對(duì)象而有差異,但均表明耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞RS是易損傷、難恢復(fù)的敏感結(jié)構(gòu)[11-14,21]。哈佛大學(xué)的Liberman等[11]發(fā)現(xiàn)成年小鼠單次100 dB SPL噪聲暴露2 h導(dǎo)致的ABR閾移雖然可以完全恢復(fù),但帶狀突觸數(shù)量卻僅能恢復(fù)50%,并存在SGN的慢性退行性死亡;Furman等[21]研究表明106 dB SPL白噪聲暴露2 h后的豚鼠,2周后ABR和DPOAE閾值完全恢復(fù)正常,但內(nèi)毛細(xì)胞上有多達(dá)30%的突觸缺失。這提示我們失重后RS損傷短期內(nèi)雖然不伴有ABR閾值的永久性閾移,但其有限的自我修復(fù)能力可能對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)造成繼發(fā)性損傷。本研究顯示模擬失重4周內(nèi)的ABR閾移在脫離失重環(huán)境7 d后完全恢復(fù),但RS數(shù)量仍存在39.12%的缺失,若RS數(shù)量不能隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增多,可能在遠(yuǎn)期造成繼發(fā)性聽(tīng)損傷。

本研究對(duì)模擬失重環(huán)境后大鼠RS帶狀體數(shù)量變化進(jìn)行了初步觀察研究,明確了模擬失重會(huì)導(dǎo)致其數(shù)量減少,且脫離暴露環(huán)境后RS有一定程度的恢復(fù),但恢復(fù)期設(shè)定較短,有必要在今后的研究中延長(zhǎng)恢復(fù)期,明確遠(yuǎn)期的RS恢復(fù)程度及聽(tīng)功能水平。模擬失重導(dǎo)致的RS損傷對(duì)聽(tīng)功能影響的具體特點(diǎn)尚不明確,還需在下一步研究中結(jié)合反映RS功能的復(fù)合動(dòng)作電位以及ABRⅠ波振幅、潛伏期等檢測(cè)指標(biāo)來(lái)確定。