苦楝提取物對奶畜乳房炎致病菌的抗菌活性研究

買 光，李占臻，安加俊，賈紅勛，白 波，尚紅梅

（1.長治市潞州區(qū)堠北莊畜牧獸醫(yī)中心站，山西 長治046000；2.咸陽市動物疫病預防控制中心）

苦楝屬楝科楝屬的落葉喬木，性寒、味苦、有毒，具有 清熱燥濕、殺蟲止癢、行氣止痛、療癬的功效［1］。現(xiàn)代藥理作用表明苦楝皮具有驅蟲，抗?jié)儭⒖垢篂a和利膽作用，其提取物具有鎮(zhèn)痛消炎、抗血栓、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性。該試驗以苦楝皮為研究對象，采用超聲波提取和紙片擴散藥敏試驗，得到苦楝提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，為獸醫(yī)臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器：紫外可見光分光光度計、烘箱、無菌操作臺、小型粉碎機、生化培養(yǎng)箱、滅菌鍋、培養(yǎng)皿、索氏抽提器。

1.1.2 樣品：試驗所用苦楝皮為苦楝全皮，樣品經(jīng)烘箱55℃烘干、粉碎，過20目篩備用。

1.1.3 供試菌種：2019年7月，山西省長治市潞州區(qū)堠北莊一奶牛散養(yǎng)戶奶牛急性乳房炎，將乳樣送至鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站，經(jīng)獸醫(yī)鏡檢與分離培養(yǎng)，初步判斷為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合感染引起的急性乳房炎。分離得到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌一直保存在堠北莊畜牧獸醫(yī)站，該試驗以這兩種菌為供試菌種。

1.2 苦楝皮提取物的制備

稱取苦楝皮粉10g，用60%的無水乙醇為溶劑，采用姜萍等［2］優(yōu)化的提取工藝，即：提取溫度60℃，料液比（質量∶體積）1∶9，提取時間80min，提取4次。合并提取物，過濾，將濾液在40℃下減壓蒸干，得到苦楝皮的粗提取物粉末。

1.3 菌懸液制備

取凍干菌種，加入0.5mlBHI培養(yǎng)基，震蕩，吸取上層懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，用無菌生理鹽水沖洗斜面，得到菌懸原液，在顯微鏡下通過血細胞計數(shù)板，稀釋調節(jié)菌體濃度為106～108個/ml，冷藏備用［3］。

1.4 苦楝液制備

以1.2中得到的苦楝皮粗提物為原料，二甲基亞砜為助溶劑，磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）為稀釋劑，配制濃度為60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.24mg/ml的苦楝溶液各10ml，用于最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定。

2 試驗方法

2.1 最小抑菌濃度的測定

將配制的不同濃度的無菌苦楝皮溶液用瓊脂稀釋法溶解在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，空白對照組加入等量無菌蒸餾水，待培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基冷凝后，用移液槍吸取2μl濃度為106～108個/ml的菌懸液接種于培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)皿上無菌落生長的最小稀釋濃度，即為苦楝皮提取液對試驗菌的最小抑菌濃度（MIC）。

2.2 最小殺菌濃度的測定

測得MIC后，將無菌落生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)18h，培養(yǎng)皿上菌落數(shù)量小于5個的最小稀釋濃度，即為苦楝皮提取液對試驗菌的最小殺菌濃度（MBC）。

3 結果與討論

3.1 MIC的測定結果（見表1）

從表1可以得出，苦楝皮提取物濃度為30mg/ml時，對大腸桿菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果；濃度為15mg/ml時，對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。馬玉翔等人［4］的研究，發(fā)現(xiàn)苦楝提取物在濃度為7.5mg/ml時就表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，該試驗是在15mg/ml才表現(xiàn)出抑菌效果，這可能與我們選用的金黃色葡萄球菌來源不同有關，也有可能與該試驗選用的是苦楝皮，馬玉翔等人選用的是苦楝種子有關。

3.2 MBC的測定結果（見表2）

表2 不同濃度苦楝皮提取物對供試菌的殺菌效果

從表2得出，苦楝皮提取物濃度為30mg/ml時，對大腸桿菌表現(xiàn)出明顯的殺菌效果；濃度為15mg/ml時，對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的殺菌效果。苦楝皮提取物對兩種供試菌均有完全殺滅作用，這與馬玉翔等人的研究相同。

4 結論

苦楝是我國常用的藥用植物，種植范圍廣泛，有清熱燥濕、殺蟲止癢、行氣止痛、療癬的功效。該研究發(fā)現(xiàn)，苦楝皮提取物有良好的抑菌、殺菌活性，是一種天然的抑菌劑，為我國大面積苦楝樹的綜合利用提供新思路。

苦楝皮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等奶畜常見的乳房炎致病菌有良好的抑菌效果，臨床可使用其提取物替代或者部分替代抗生素的應用，從而為奶畜乳房炎無抗治療研究提供理論依據(jù)。