低聚果糖通過調整腸道菌群改善川崎病小鼠冠狀動脈損傷的機制

錢范宇，章啟豪，岑建柯，周錦慧，李睿心，葉子，吳夢涵，王方巖，褚茂平，張春祥

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童心血管內科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學病理生理學教研室，浙江 溫州 325035

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種好發于6個月至2歲嬰幼兒，以全身血管炎癥為主要病變的急性獲得性心血管疾病[1-2]。其最主要的并發癥為冠狀動脈病變，一直未經治療的KD有25%的病例會發展成為冠狀動脈瘤，威脅患兒生命健康[3]。目前KD的發病原因及內在機制仍未被完全闡明。有研究認為，免疫系統的異常激活、炎癥因子的級聯放大效應為其中比較重要的病理機制，而巨噬細胞作為KD血管炎癥的驅動因素尤為重要[4-6]。

腸道微生態是微生物、細菌、病毒、原生動物和真菌，以及它們在胃腸道中存在的集體遺傳物質的總和[7]。研究表明，許多全身性疾病的發生發展與腸道微生態的變化密切相關。有學者對KD患兒的腸道菌群16S測序發現，KD腸道菌群存在明顯失衡，主要表現為有害菌（如鏈球菌屬、腸球菌屬）的增加和有益菌（如乳酸桿菌屬）的減少[8-10]。但目前針對腸道菌群與KD冠狀動脈損傷程度的研究鮮有報道。

低聚果糖（fructo-oligosaccharide，FOS）是一種益生元，能促進腸道內產短鏈脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFAs）益生菌的增殖，抑制有害菌的生長，保持腸道微生態的平衡[11]。其中最主要的3種SCFAs乙酸、丙酸、丁酸已被證實可以通過多種機制抑制炎癥，影響全身疾病如炎癥性腸病、胰腺炎、動脈粥樣硬化等的發生發展[12-15]。而對于KD來說，SCFAs在腸道內的含量變化是否會改變KD冠狀動脈的病理損傷，尤其是冠狀動脈炎癥性病變仍需進行探究。本研究探討FOS是否通過調整腸道菌群改善KD小鼠冠狀動脈損傷，并對其機制進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級C57BL/6雄性小鼠30只，體質量18～20 g，4～6周齡，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號碼：SYXK（浙）2018-0017。HE染色試劑購自北京索萊寶有限公司，CD68一抗試劑購于美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 KD小鼠動物模型的建立：按照文獻KD模型造模方法[16-17]，采用白色念珠菌細胞壁水溶性成份（candida albicans cell wall extracts，CAWS）腹腔注射[4 mg/（只·d），連續5 d]，建立KD小鼠模型。小鼠隨機分為正常對照組（PBS組），KD造模組（CAWS組），FOS+KD造模組（FOS組）3組，每組10只。以相同方式腹腔注射PBS后正常飼養作為正常對照。FOS組除了飼料中加入了5%的FOS外，其余同CAWS組。造模過程中，每天對小鼠進行兩次檢查，特別關注特定的疾病體征，包括體質量減輕＞10%、活動能力下降、皮毛皺褶、駝背步態、不活動或進食和飲水困難。如果在任何時候出現兩種或兩種以上的癥狀，就用戊巴比妥鈉將動物進行人道處死。造模完成后28 d處死各組小鼠，每只小鼠取2份糞便樣本，立即液氮冷凍，及時送檢。取心臟組織置于-80 ℃環境保存。

1.2.2 HE染色：按照HE試劑盒說明書，對各組小鼠心肌切片進行染色，觀察冠狀動脈的炎癥情況。

1.2.3 組織免疫熒光染色：心肌組織進行常規石蠟包埋、切片、烤片步驟。浸泡二甲苯15 min 2次后，梯度水化，PBS洗2次5 min后進行高壓抗原修復，后用5% BSA封閉，最后用CD68（1:100，美國Proteintech公司）處理，4 ℃冰箱過夜。第2天取出復溫30 min，PBS洗3遍后，加熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3遍后加DIPI熒光淬滅劑封片，鏡檢。

1.2.4 糞便16S rRNA檢測：每只小鼠的糞便送至北京諾和致源科技股份有限公司，運用高通量測序技術，進行16S rRNA V3和V4區擴增和測序，并在其Illumina MiSeq測序平臺進行分析。

1.2.5 糞便SCFAs含量測定：取樣本50 mg，加50 μL 15%磷酸，再加上125 μg/mL的內標（異己酸）溶液100 μL和乙醚400 μL勻漿1 min，于4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液。運用氣相色譜與質譜聯用技術（GS-MS）檢測方法，對糞便中SCFAs乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸的含量進行檢測。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOS減少KD冠狀動脈炎癥浸潤，改善病理損傷各組小鼠心肌冠狀動脈HE染色發現，CAWS組小鼠冠狀動脈結構與PBS組不同，出現水腫增厚和管腔縮小的變化，且周圍原本正常的心肌組織已完全消失，取而代之的為大量染色較深的單核細胞等炎癥細胞，提示冠狀動脈損傷嚴重（見圖1A）。免疫熒光顯示CAWS組冠狀動脈周圍CD68熒光強度（紅色）明顯增強（見圖1B），說明巨噬細胞浸潤明顯，炎癥較為嚴重。FOS處理后冠狀動脈周圍損傷明顯減輕（見圖1A），巨噬細胞熒光強度減弱，浸潤范圍縮小（見圖1B）。

圖1 各組心肌冠狀動脈HE染色（A）和CD68組織熒光染色（B）

2.2 FOS改善KD小鼠腸道菌群變化 通過對小鼠糞便細菌的16S rRNA的V3-V4區段進行高通量測序，結果顯示CAWS組的腸道菌群與PBS組的明顯不同，菌群組成形成差異（見圖2A），菌群種類下降（見圖2B）。通過熱圖在門水平和屬水平同樣能發現CAWS組腸道菌群相較于PBS組出現紊亂（見圖2CD）。KD造模的小鼠在加入FOS后，腸道菌群出現明顯的調整，厚壁菌門（Firmicutes）比例重新上升（見圖2C），其中能發酵產生SCFAs的菌屬Klebsiella、Lachnospiraceae、Citrobacter等出現上升（見圖2D）。

2.3 FOS上調了腸道菌群中產SCFAs的菌群比例已知厚壁菌門是產SCFAs菌群較為集中之處，于是我們觀察到在門水平上，FOS組的菌群比例接近于PBS組。與CAWS組相比，FOS組中厚壁菌門出現上升，擬桿菌門（Bacteroidetes）出現下降（見圖3A），且發酵碳水化合物產生SCFAs的毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae）出現明顯的上升（見圖3B）。通過對前40種差異菌屬中的產SCFAs菌進行分析，我們發現CAWS組中產生SCFAs的細菌Blautia、Roseburia、Bacteroides明顯減少，FOS干預后出現明顯的上升（見圖3C-E）。

2.4 FOS提高了SCFAs產量 為了更加直觀地了解產SCFAs菌種差異是否確實影響腸道內SCFAs的含量，我們用GS-MS法直接測定糞便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸的含量，結果顯示，相對于PBS組，CAWS組所檢測的SCFAs均出現降低（P＜0.05），經FOS處理后，這些SCFAs含量顯著增加（見圖4）。

3 討論

腸道菌群對機體生理功能和各系統器官疾病的發生發展均有十分重要的影響。在心血管炎癥方面，已有廣泛研究明確了菌群是重要的參與者。6個月至3歲是腸道微生態構建的關鍵時期，也是KD的高發期，這提示腸道菌群與KD之間很可能存在密切的聯系。前期的研究已發現KD患兒的菌群與正常兒童相較具有顯著的差異[9-10]，但這種差異與KD嚴重程度的相關性仍有待明確。

FOS是一種生產商品化并且應用廣泛的益生元，在腸道內能促進有益菌的生長。FOS通過調整腸道菌群組成，增加SCFAs等有益代謝產物生成，從而增強腸道免疫屏障。有報道稱定期攝入足夠的FOS對腸胃疾病、肥胖、腹瀉、骨質疏松、動脈粥樣硬化和2型糖尿病等疾病均有益處[11]。而FOS是否有益于KD，目前未見此方面的研究。我們發現給KD小鼠攝入定量的FOS后，其冠狀動脈周圍病理損傷明顯減輕，巨噬細胞的浸潤情況也明顯緩解。為深入探究KD小鼠是否確實存在腸道菌群紊亂的情況，以及FOS的攝入是否重新調整菌群結構，我們采用16S rRNA測序技術檢測小鼠糞便中的菌群組成情況，結果顯示KD小鼠的腸道菌群與正常小鼠腸道菌群存在較大差異，出現明顯的紊亂現象；而加入FOS后，腸道菌群比例重新趨于正常。有研究顯示來自厚壁菌門的Phascolarctobacterium、Roseburia、Blautia、Faecalibacterium、Clostridium、Subdoligranulum、Ruminococcus、Coprococcus屬以及來自擬桿菌門的Bacteroides屬共9個菌均屬具有產生SCFAs的能力，屬于有益菌群[18]。以此為參照，本研究關注到前40個各組差異最明顯的菌群中，CAWS組產SCFAs的菌群均下降，加入FOS后部分產SCFAs菌群上升。SCFAs的結果提示，在FOS處理后確實提高了糞便中SCFAs含量。以此我們認為，FOS可能通過提高腸道內產SCFAs有益菌群的比例，減輕KD的冠狀動脈損傷。

圖2 小鼠糞便16S rRNA高通量測序

圖3 各組腸道菌群差異

圖4 各組糞便中SCFAs的含量

近年，SCFAs，特別是乙酸、丙酸、丁酸的抗炎效應已得到廣泛的認可。在心血管疾病方面，BARTOLOMAEUS等[19]在小鼠的高血壓模型中發現，SCFAs（如丙酸）的抗炎作用顯著減少了效應記憶T細胞和Th17細胞的數量，從而減輕高血壓造成的心血管損傷。Casp1-/-小鼠中產生SCFAs的微生物群減少，進而導致盲腸中微生物來源的丙酸、乙酸和丁酸減少，從而加速炎癥和動脈粥樣硬化的發生[20]。丁酸也可以通過抑制氧化應激和炎癥，抑制血管平滑肌增殖，對心血管產生保護作用，如抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，調節血壓等[12，14]。目前SCFAs在KD中的研究甚少，近期有報道發現，腸道內的SCFAs特別是丁酸產量下降造成的Th17/Treg失衡，可導致KD的高細胞因子血癥的發生[21]。我們通過實際測量糞便中的SCFAs確實發現在FOS處理后所有SCFAs上升，故本研究中FOS可能是通過提高腸道內有抗炎能力的SCFAs，來緩解KD冠狀動脈損傷情況。目前研究表明SCFAs的抗炎效應主要是通過G蛋白偶聯受體通路完成，如乙酸和丁酸作用于GPR41和GPR43，丁酸則通過丁酸的特性受體GPR109A或者GPR43發揮作用[22-24]。此外，組蛋白去乙酰化酶的抑制作用也是丁酸抑炎的途徑之一[25]。丁酸因在心血管系統疾病中表現出顯著的抑炎作用，故我們推測可能是丁酸在KD中發揮了作用，但具體機制還有待進一步探索。

綜上所述，FOS能恢復KD炎癥小鼠的腸道微生態，增加有益菌群，特別是產SCFAs菌，從而提高腸道內SCFAs濃度，減輕巨噬細胞浸潤造成的KD冠狀動脈損傷。