樹舌靈芝優(yōu)良菌株的篩選*

蘭玉菲，王慶武，孔 怡，高 霞，叢倩倩

（1.泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 泰安 271000；2.山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，山東 濟南 250100）

樹舌靈芝（Ganoderma applanatum） 隸屬于擔(dān)子菌綱 （Basitdiomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 多孔菌科 （Polyporaceae） 靈芝屬 （Ganoderma），為我國傳統(tǒng)的藥用真菌。樹舌靈芝性平，味苦，具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤、抑菌消炎等多種功效[1－4]。樹舌靈芝含有的多糖等多種活性成分能抑制乙肝病毒，調(diào)節(jié)機體免疫功能，抑制血小板凝集，已開發(fā)為治療乙型肝炎的藥物，如“復(fù)方樹舌片”“肝必復(fù)”和“樹舌肝泰”等，市場需求量大，應(yīng)用前景廣闊[5－6]。2009年以來，筆者采集野生樹舌靈芝種質(zhì)資源并進行了馴化栽培，目前已取得成功并具有一定的規(guī)模，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟效益。

目前國內(nèi)外樹舌靈芝的研究大多集中在提取物的分離及藥理活性研究等方面[7－9]，樹舌靈芝馴化栽培方面較少，導(dǎo)致生產(chǎn)中缺乏優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的菌株，嚴重影響樹舌靈芝野生資源的開發(fā)利用。本試驗對不同來源的10個野生樹舌靈芝分離菌株進行了菌絲生長、液體菌種和出菇篩選試驗，以期獲得產(chǎn)量高、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良且性狀穩(wěn)定，適合人工栽培的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗供試菌株均為筆者從泰安及其周邊地區(qū)收集的野生樹舌靈芝子實體上分離純化后獲得，保存于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌研究所。來源、采集時間及編號見表1。

表1 供試菌株來源、采集時間及編號Tab.1 Origin,collection date and designation of Ganoderma applanatum isolates

1.2 培養(yǎng)基及栽培基質(zhì)

PDA固體培養(yǎng)基：具體配方與制備方法參見參考文獻[10]。

PDA液體培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基不加瓊脂。

母種培養(yǎng)基為PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L－1（去皮煮汁）、葡萄糖 20 g·L－1、蛋白胨 3 g·L－1、磷酸二氫鉀 3 g·L－1、硫酸鎂 1.5 g·L－1、瓊脂 20 g·L－1，pH自然。

原種培養(yǎng)基配方：棉籽殼39%、玉米芯20%、闊葉樹木屑30%、麥麩8%、生石灰粉1%、硫酸鈣1%、蔗糖1%，含水量60%～65%。

栽培種培養(yǎng)基配方：棉籽殼40%、玉米芯20%、闊葉樹木屑30%、麥麩8%、生石灰粉1%、硫酸鈣1%，含水量60%～65%。

1.3 拮抗試驗

在無菌條件下將10個供試菌株中的任意2個菌株配對組合，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃恒溫箱中進行對峙培養(yǎng)，觀察有無拮抗反應(yīng)。

1.4 菌絲生長試驗

1.4.1 固體培養(yǎng)

將保存的斜面菌種活化后接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d，采用“十字交叉法”測量菌落直徑，計算菌絲平均生長速率（mm·d－1）。同時觀察菌絲長勢并比較不同菌株的菌落形態(tài)。每個菌株設(shè)5個重復(fù)。

1.4.2 液體培養(yǎng)

取PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)的菌塊（0.5 mm2）接種于PDA液體培養(yǎng)基中，每瓶接種3個菌塊，溫度28℃，150 r·min－1振蕩培養(yǎng) 9 d。收集菌絲體，過濾后50℃烘干1 d，稱重，計算菌絲體得率。每個菌株設(shè)3次重復(fù)。

1.5 出菇試驗

采用熟料栽培，聚丙烯塑料袋規(guī)格為18 cm×39 cm×0.004 cm，菇棚內(nèi)墻式排袋兩端割口出芝。發(fā)菌期間，觀察菌絲長勢，用劃線法測定菌絲生長速度，調(diào)查菌袋污染情況并及時清理。出芝期間觀察和記錄子實體形態(tài)特征，調(diào)查出芝期菌袋污染率，統(tǒng)計產(chǎn)量。

1.6 優(yōu)良菌株栽培穩(wěn)定性試驗

選取生物學(xué)效率高、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的菌株進行栽培穩(wěn)定性試驗。出菇試驗同1.5。每次接種50袋，共3次。觀察出芝情況，記錄產(chǎn)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

干芝生物學(xué)效率（P，%） 公式為：

式中：m1表示子實體干重（g）；m2表示培養(yǎng)料干重（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株拮抗試驗分析

10個供試菌株間均存在拮抗反應(yīng)，表明所用試驗材料為不同的菌株。

2.2 樹舌靈芝菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長情況

10個樹舌靈芝菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速度和菌絲長勢差異較大，具體見表2。

從表2可以看出，普照樹舌、肥城樹舌菌株菌絲生長速率最快，均為 6.29 mm·d－1，其次是孔樹舌5516和孔樹舌5菌株，菌絲生長速率分別為5.98 mm·d－1和 5.91 mm·d－1；孔樹舌 5514 菌株菌絲生長速率最慢，僅為 2.32 mm·d－1，其次是孔樹舌 8 菌株，為 4.18 mm·d－1；其余菌株菌絲生長速率在5.13 mm·d－1～5.80 mm·d－1。

表2 10個樹舌靈芝菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長特性Tab.2 Mycelial growth characteristics of ten Ganoderma applanatum strains on PDA medium

2.3 樹舌靈芝菌株在液體培養(yǎng)基中的菌絲體得率情況

不同樹舌靈芝菌株在液體培養(yǎng)基中生長情況差異較大。菌株孔樹舌5在液體培養(yǎng)基中菌絲球形成早、生長快，菌絲體得率最高，為 4.1 g·L－1，藥鄉(xiāng)樹舌和普照樹舌2個菌株的菌絲體得率均為3.3 g·L－1，肥城樹舌菌株菌絲體得率為3.2 g·L－1，孔樹舌9857菌株菌絲體得率最低，僅為 1.8 g·L－1，孔樹舌 8菌株污染，其余4個菌株的菌絲體得率均較低，在2.0 g·L－1～2.5 g·L－1之間。

2.4 樹舌靈芝菌株品比試驗結(jié)果

10個供試菌株在原種菌絲生長速率、出原基時間、菌蓋大小及厚度、產(chǎn)量等方面存在差異，具體見表3。

從表3可以看出，原種菌絲生長速率最快的為孔樹舌 5514 菌株，為 8.31 mm·d－1，其次是肥城樹舌和孔樹舌 5522 菌株，均為 8.12 mm·d－1，藥鄉(xiāng)樹舌菌株最慢，僅為5.60 mm·d－1；出原基時間最早的菌株為孔樹舌9857，開口8 d即產(chǎn)生原基，其次是孔樹舌5菌株，開口9 d產(chǎn)生原基，出原基最晚的菌株為孔樹舌9851和孔樹舌5516菌株，開口26 d才產(chǎn)生原基，其余菌株產(chǎn)生原基時間均在11 d～12 d；藥鄉(xiāng)樹舌菌蓋最大，為9.90 cm×7.36 cm，其次是普照樹舌、孔樹舌5516菌株，菌蓋橫徑均大于或等于9.57 cm，縱徑均大于或等于6.09 cm，孔樹舌5菌株菌蓋最厚，為1.71 cm，其次是孔樹舌5516菌株，為1.61 cm，孔樹舌5522菌株菌蓋最薄，僅為1.05 cm；菌蓋顏色除了普照樹舌和肥城樹舌菌株為褐色，其他菌株均為淺褐色；產(chǎn)量最高的為菌株孔樹舌5（生物學(xué)效率為9.10%），其次是菌株普照樹舌（生物學(xué)效率為8.53%），孔樹舌9851菌株產(chǎn)量最低（生物學(xué)效率僅為3.64%）。

表3 10個樹舌靈芝菌株的出菇性狀Tab.3 Fruiting characteristics of Ten Ganoderma applanatum strains

2.5 孔樹舌5和普照樹舌菌株出菇性狀穩(wěn)定性

孔樹舌5和普照樹舌菌株的出菇穩(wěn)定性比較情況見表4。

從表4可以看出，孔樹舌5和普照樹舌菌株在3次栽培出菇試驗中，原種菌絲生長速率、出原基時間和產(chǎn)量沒有顯著差異，因此孔樹舌5和普照樹舌菌株有較好的出菇穩(wěn)定性。

表4 孔樹舌5（KSS5）和普照樹舌（PZSS）菌株出菇穩(wěn)定性比較Tab.4 Fruiting stability of Ganoderma applanatum KSS5 and PZSS strains

3 結(jié)論

本試驗從山東不同地區(qū)采集野生樹舌靈芝子實體分離純化獲得10個樹舌靈芝菌株，通過比較10個菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長情況以及在液體培養(yǎng)基中的菌絲體得率情況和栽培試驗中的出菇性狀，綜合比較篩選出優(yōu)良菌株孔樹舌5和普照樹舌菌株，并通過穩(wěn)定性試驗證明優(yōu)良性狀能夠穩(wěn)定遺傳。

沈天峰等[11]研究結(jié)果表明平菇（Pleurotus ostreatus）母種菌絲體生長速度與子實體產(chǎn)量相關(guān)性不顯著，原種菌絲體生長速度與子實體產(chǎn)量呈負相關(guān)。杜萍等[12]報道黑木耳（Auricularia auricula） 菌絲生長速度與產(chǎn)量沒有顯著相關(guān)性。本試驗研究結(jié)果表明，樹舌靈芝菌株在PDA培養(yǎng)基和原種栽培基質(zhì)上的菌絲生長速度以及原基形成時間等均與產(chǎn)量沒有明顯的相關(guān)性，與后者研究結(jié)果相似。

目前進行樹舌靈芝優(yōu)良菌株的篩選主要是通過出菇試驗，以產(chǎn)量為主要衡量指標，綜合其他農(nóng)藝性狀來進行選擇。后續(xù)試驗將對不同樹舌靈芝菌株的多糖含量及活性等進行研究，有望實現(xiàn)樹舌靈芝優(yōu)良菌株的早期鑒定，加快菌株選育的效率。