ANGPTL8在大鼠著床后雌激素短暫缺乏胎盤中的表達及其對人臍靜脈內皮細胞功能的影響

祝立權，孫明明，梁敏，刁天，楊麗君，張欣，劉婷婷，汪坤，魯聰，陳西華，徐祥波，賀斌*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所 國家衛生健康委生殖健康工程技術研究中心，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730)

雌激素和孕激素是重要的甾體類激素，對于妊娠起始、妊娠中胎盤功能的維持、胎兒生長發育以及分娩發動都起著重要作用[1]。雌激素的缺乏會導致各種并發癥和不良的妊娠結局。

雌二醇(E2)刺激體內外內皮細胞增殖[2-4]，增強人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)對各種基質蛋白的粘附，促進細胞遷移，從而促進血管生成[2，5]。胎盤是母親和胎兒進行營養物質和代謝廢物交換的重要結構，完善的胎盤血管網絡能夠使這種交換活動正常進行。前期研究結果顯示，在著床后短暫抑制雌激素造成了實驗組大鼠胎盤連接區呈現異常增生，迷路區血流交換不足，影響了妊娠晚期胎盤的正常發育[6]，但具體機制尚不清楚。

血管生成素樣蛋白8(ANGPTL8)是血管生成素樣蛋白(ANGPTLs)家族新發現的一種蛋白，與ANGPTL1～7不同的是它只有N端結構域，并且與ANGPTL3和ANGPTL4表現出同源性[7]，可以與脂蛋白脂肪酶(LPL)結合調節甘油三酯(TG)的代謝[8]。妊娠并發癥常常伴有糖脂代謝的異常，本研究旨在探索大鼠著床后雌激素短暫缺乏胎盤中ANGPTL8的表達及對HUVEC功能的影響。

材料與方法

一、實驗動物

SPFⅡ級Wistar雄性大鼠15只(8～10周齡)，SPFⅡ級Wistar雌性大鼠(8～10周齡)40只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。Wistar大鼠均自由進食和飲水，飼養條件恒溫恒濕，光照和黑暗時間均為12 h。所有實驗相關操作均符合國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會的相關規定。

二、實驗方法

1.大鼠胚胎著床后短暫雌激素缺乏模型的建立：雌雄大鼠按照1∶1的比例于當日21：00合籠，次日上午9：00見陰栓記為妊娠0.5 d(GD 0.5)。實驗組雌性大鼠(n=20)在GD 6.5～GD 8.5的上午9：00按照每只0.16 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃雌二醇(E2)抑制劑來曲唑(Femara，諾華制藥，瑞士)；對照組雌性大鼠(n=20)在相同的時間點灌胃等量溶劑(羧甲基纖維素鈉，北京化學試劑)。在GD 8.5和GD 19.5的上午9：00處死大鼠，分別取著床點(GD 8.5)和胎盤(GD 19.5)組織凍存于-80℃，用于提取組織蛋白質和RNA。

2.檢測Angptl8 mRNA的表達：向樣本組織中加入Trizol以提取組織中的總RNA，使用逆轉錄試劑盒(RR037A，Takara，日本)進行反轉錄，獲取cDNA。使用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(RR820A，Takara，日本)進行Real-time PCR反應，Angptl8正向引物為5′-CCACCTCTTGTGGGCTCTCAC-3′，反向引物為5′-TCTCTGCTGGATCTGCCGCA-3′，內參為β-actin，40個循環擴增后采用2-ΔΔCt法計算結果。

3.Western blot檢測ANGPTL8蛋白的表達：提取樣本組織中總蛋白；使用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific，美國)測定組織中總蛋白的濃度；使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天)配制10%凝膠，上樣(加樣體積為20 μl)，電泳，轉膜，10%脫脂奶粉室溫封閉后，將ANGPTL8蛋白抗體(1∶1 000；Novus，美國)和β-actin抗體(1∶3 000；Proteintech，美國)分別與山羊抗兔二抗(1∶4 000；Cell Signaling，美國)孵育1.5 h；使用超敏ECL化學發光液試劑盒(蘇州新賽美)進行發光顯影。用Image J分析蛋白條帶。

4.細胞培養與分組：人臍靜脈內皮細胞(HUVEC，北京協和細胞資源中心)用ECM培養基(Sciencell，美國)進行常規培養，培養條件37℃、5%CO2。添加不同濃度的重組人ANGPTL8(Novus，美國)處理HUVEC，使其終濃度分別為0、1、2、4、8 nmol/L，每組設5個復孔，其中0 nmol/L組為對照組。

5.細胞劃痕實驗：將生長狀態良好的細胞接種于6孔板中，接種密度為5×105/ml，并置于37℃、5%CO2培養箱中培養12 h。次日用無菌槍頭在培養皿底部劃出水平劃痕，用PBS清洗劃下的細胞，清洗3次；然后加入無血清培養基放在37℃、5%CO2培養箱中培養，在0、12、24、48 h拍照記錄；采用Image J軟件對結果數據進行分析。

6.細胞侵襲實驗：將Matrigel基質膠(BD，美國)用無血清培養基稀釋15倍，100 μl/孔平鋪于Transwell小室內，并置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育2 h待其充分凝固；按照1×105/ml的比例將細胞懸液加入到Transwell上室內，每孔100 μl，在下室中加入600 μl完全培養基，放入37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育12、24 h；用1×PBS清洗后加入甲醇固定細胞15 min；2.5%的結晶紫染液染色15 min，洗凈小室，用棉簽輕輕拭去小室內側細胞，倒置風干后用倒置顯微鏡觀察記錄Transwell小室內5個視野內的細胞數量。

7.血管生成實驗：將預冷的Matrigel基質膠按照每孔50 μl的體積快速鋪于96孔板中，然后置于37℃、5%CO2培養箱中靜置2 h，待其充分凝固，按照2×105/ml的比例將細胞懸液加入到96孔板中，每孔100 μl，繼續培養4～6 h，觀察各組細胞的成管情況，并隨機選擇6個視野進行拍照，采用Image J軟件對成管情況進行分析。

三、統計學分析

結 果

一、著床點和胎盤組織中Angptl8 mRNA以及蛋白的表達

在GD 8.5時，實驗組著床點Angptl8 mRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；而在GD 19.5時，實驗組與對照組胎盤組織中Angptl8 mRNA的表達無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.05圖1 大鼠著床點(GD8.5)和胎盤組織(GD19.5)中的Angtpl8 mRNA表達

在GD 8.5時，實驗組著床點ANGPTL8蛋白的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；在GD 19.5時，實驗組胚胎組織中ANGPTL8蛋白的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)(圖2)。

A：GD8.5著床點組織；B：GD19.5胎盤組織；C：ANGPTL8蛋白的相對表達量。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 大鼠著床點(GD8.5)和胎盤組織(GD19.5)中的ANGPTL8蛋白表達

二、ANGPTL8對HUVECs功能的影響

1.ANGPTL8對HUVECs遷移的影響：在ANGPTL8對HUVECs處理24 h后，與對照組(0 nmol/L組)比較，ANGPTL8的濃度越高，劃痕的間隔越大，提示HUVECs的遷移率顯著降低(P<0.01)(表1、圖3)。

圖3 不同濃度ANGPTL8對HUVECs細胞遷移的影響

表1 不同濃度ANGPTL8對HUVECs遷移的影響(-±s)

2.ANGPTL8對HUVECs侵襲的影響：與對照組(0 nmol/L組)比較，不同濃度ANGPTL8分別處理HUVECs 12 h和24 h后，HUVECs細胞侵襲數目均隨著ANGPTL8濃度的升高而顯著降低(P<0.05)(表2、圖4)。

圖4 不同濃度ANGPTL8對HUVECs細胞侵襲的影響(結晶紫染色 ×100)

表2 不同濃度ANGPTL8對HUVECs侵襲的影響(-±s)

3.ANGPTL8對HUVECs成管的影響：與對照組(0 nmol/L組)比較，不同濃度ANGPTL8處理HUVECs后，HUVECs細胞成管數目隨著ANGPTL8濃度的升高而顯著降低(P<0.01)(表3、圖5)。

圖5 不同濃度ANGPTL8對HUVECs細胞成管的影響(×100)

表3 不同濃度ANGPTL8對HUVECs成管的影響(-±s)

討 論

胎兒的健康發育有賴于營養物質和氧氣通過胎盤的傳遞，胎盤適當的血管化和灌注(胎盤血管生成)對于胎盤的發育和成熟至關重要。胎盤血管發育和適應性的破壞與不良妊娠結局有關，包括先兆子癇、胎兒宮內發育遲緩、死胎等。前期研究中發現，在大鼠著床后短暫雌激素缺乏模型中，胎盤迷路區血管網發育呈現異常，然而雌激素僅在妊娠早期偏低，在妊娠中后期雌激素水平并無顯著差異，提示雌激素并不是導致胎盤發育異常的直接原因[1，9]。因此在雌激素短暫缺乏下，胎盤發育異常的機制需進一步研究。

ANGPTL8是ANGPTLs家族成員之一，是一種具有198個氨基酸的22 kDa蛋白[7]。ANGPTL1～7由常見的結構域包括氨基端(N-末端)信號肽、N-端卷曲螺旋結構域(CCD)、羧基末端(C-末端)纖維蛋白原樣結構域組成(FLD)和連接區域，但是ANGPTL8缺少C端FLD[10]，它和ANGPTL3與ANGPTL4具有相同的N端結構域。ANGPTL8和ANGPTL3與ANGPTL4形成復合物的形式共同參與調節脂蛋白脂酶(LPL)的活性，進而調節甘油三酯(TG)代謝，ANGPTL8被認為是ANGPTL家族里一種新穎但非典型的成員并且能夠在脂質代謝中發揮作用的蛋白質[7，10-11]。有研究顯示，ANGPTL3/8復合物蛋白比為3∶1，ANGPTL4/8復合物蛋白比為1∶1，通過形成復合物，ANGPTL3/8的LPL抑制活性比ANGPTL3強100倍以上，而ANGPTL4/8的LPL抑制活性比ANGPTL4弱100倍以上[12]。

本研究發現，在胚胎著床后短暫抑制雌激素后的胎盤發育過程中，GD 8.5和GD 19.5時實驗組著床點及胎盤組織中蛋白的表達水平均高于對照組，但實驗組Angptl8 mRNA僅在GD 8.5的著床點組織中表達升高，而在GD 19.5時，Angptl8 mRNA在實驗組與對照組胎盤組織中的表達無顯著差異，提示ANGPTL8蛋白的升高可能不是由胎盤組織表達增強的原因，更可能是來自子宮組織合成或來自母體循環。我們利用重組人ANGPTL8分子研究了其對HUVEC細胞功能的影響，結果顯示，隨著ANGPTL8濃度的升高，其對HUVECs的遷移、侵襲和成管產生了抑制作用且有劑量依賴性，這表明ANGPTL8的上調抑制了大鼠胚胎著床后短暫雌激素缺乏模型中胎盤血管網的正常發育。原因可能是高濃度的ANGPTL8通過影響ANGPTL3/4復合體對LPL的抑制作用進而抑制甘油三酯水解，從而影響到血管內皮的功能，具體機制包括ANGPTL8升高的原因有待于進一步深入研究。另一方面，有流行病學研究表明，外周循環的ANGPTL8水平在代謝性疾病，包括糖尿病、肥胖和代謝綜合征中發生變化，呈現高水平[13]。不僅如此，有研究顯示在患有妊娠期糖尿病的孕婦中，胎兒臍帶血中的ANGPTL8水平高于母體血清中的ANGPTL8水平，提示母體和臍帶血ANGPTL8的增加可能是增強妊娠期糖尿病患者胰島素需求的補償機制[14]。有關ANGPTL8在病理性妊娠中的作用機制仍有待進一步研究。

胎盤發生過程中新生血管生成的過程稱為血管生成，起始于胚外中胚層尿囊中內皮祖細胞(成血管細胞)的形成[15]，完善的胎盤血管網絡是母體和胎兒之間進行物質交換的保證。胎盤血管生成異常會產生不良的妊娠結局以及母親和胎兒患有各種并發癥。因此，通過研究在雌激素缺乏下ANGPTL8對胎盤發育的影響機制，有助于為妊娠并發癥以及各種不良妊娠結局提供預防和治療的手段。