基于網絡藥理學探究三七-扶芳藤藥對治療心力衰竭的作用機制

莫霄云，楊 朔，黃 琛，何貴新

三七為五加科人參屬植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根莖，為廣西地道藥材[1]。《玉楸藥解》載 “和營止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血”[2]。三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效。扶芳藤[Euonymus fortunei(Turcz.)Hand.-Mazz]為衛矛科常綠藤本灌木，又名衛生草、巖青藤、巖青杠等，《本草拾遺》記載：“扶芳藤，無毒，味苦，小溫，主一切氣，一切血，一切冷，去百病……久服延年”[3]。扶芳藤具有益氣血、補肝腎、舒筋活絡、止血化瘀等功效。現代藥理研究表明，三七、扶芳藤具有抗氧化、抗血栓、心臟保護、抗腫瘤、神經保護、抗內毒素等多種藥理作用，其對心血管系統、神經系統及血液系統等均有良好的臨床治療效果[4-5]。網絡藥理學將生物學網絡與藥物作用網絡整合，探究疾病及藥物的相互作用機制，與復雜疾病的治療理念相吻合，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點的預測及中藥作用機制的闡述方面[6]。本研究以三七-扶芳藤藥對為研究對象，建立三七-扶芳藤“成分-靶點-心力衰竭”復雜網絡，從網絡藥理學角度闡釋三七-扶芳藤治療心力衰竭的有效成分及其關鍵靶點，揭示三七-扶芳藤的藥效物質基礎和治療心力衰竭的療效機制。

1 資料與方法

1.1 檢索數據庫 檢索數據庫包括：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systema pharmacolgy databas and analysis platform，TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，Uniprot數據庫(https：// www.uniprot.org/)，Swiss Target Prediction數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，Gene Cards數據庫(https：// www.genecards.org/)，STRING數據庫(https：//string-db.org/)，Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，CytoScape3.7.1軟件，R3.6.0軟件等。

1.2 藥物作用靶點篩選 在TCMSP數據庫中檢索三七、扶芳藤，并結合文獻收集三七-扶芳藤藥對內各藥物的化學成分及靶點信息，使用Uniprot數據庫，將藥物的靶點名稱進行矯正統一，并使用Swiss Target Prediction數據庫對藥物的靶點信息進行補充。

1.3 疾病作用靶點篩選 使用GeneCards數據庫以“heart failure”為關鍵詞進行檢索，獲得疾病作用靶點。

1.4 藥物-疾病共同靶點的篩選 在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上分別錄入三七-扶芳藤與心力衰竭的靶點，繪制韋恩圖，得到藥物與疾病的共同靶點。

1.5 網絡模型的構建及分析 使用CytoScape3.7.1軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網絡圖，使用Network Analyzer功能對中藥復方的主要活性成分進行分析。

1.6 構建蛋白相互作用關系網絡圖 將上述藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數據庫中進行檢索，選取minimum required interaction score>0.4，構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，并根據蛋白之間的關聯度進行排序。

1.7 通路富集分析 在R軟件安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將藥物-疾病共同靶點轉換成entrezID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據已轉換的entrezID，以P<0.05，Q<0.05進行關鍵靶基因本體(gene ontology，GO)注釋及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)功能富集分析，并將結果以條形圖形式輸出。

2 結 果

2.1 三七-扶芳藤藥對有效活性成分及靶點篩選 在TCMSP數據庫中設定生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，對2味藥物的有效成分進行篩選，結合文獻補充納入三七[7]中的人參皂苷rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1，扶芳藤[8]中的衛矛醇、兒茶素、木栓酮、沒食子酸。去重后共得到有效活性成分16個，分別包括三七12個、扶芳藤4個。詳見表1、表2。將活性成分對應的靶點輸入UniProt數據庫，并使用Swiss Target Prediction數據庫對靶點信息進行補充，刪除去重，共篩選出345個藥物靶點(其中三七187個，扶芳藤193個)。

表1 三七-扶芳藤藥對中藥物-成分-靶標基本信息

表2 三七-扶芳藤藥對的有效活性成分信息

2.2 藥物-疾病共同靶點的獲取 以“heart failure”為關鍵詞在GeneCards數據庫進行檢索，去重后共獲得相關靶點1 0961個，取排名居前2 000位作為研究靶點。在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入345個藥物靶點、2 000個疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點148個。詳見圖1。

圖1 三七-扶芳藤與心力衰竭靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖的構建 將三七-扶芳藤藥對中16個潛在活性成分與148個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，繪制出藥物-成分-靶點-疾病相互作用的網絡圖。詳見圖2。圖中紫色代表藥物，藍色代表中藥復方中的15種活性成分(1個活性成分靶點與疾病靶點無交集，予刪除)，綠色代表包括環加氧酶1(PTGS1)、基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、信號傳導及轉錄激活蛋白(STAT1)、血管內皮生長因子(VEGFA)、蛋白激酶(AKT1)、C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白介素-6(IL-6)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、低聚果糖(FOS)在內的148個共同靶點，紅色代表疾病。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病相互作用的網絡圖

2.4 蛋白相關作用關系網絡圖的構建 在STRING數據庫中錄入上述148個共同靶點，分析得到蛋白相互作用的PPI網絡。詳見圖3。每條邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多代表關聯度越大，得到PPI圖中包括IL-6、AKT1、VEGFA、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生長因子(EGF)、表皮生長因子受體(EGFR)等排名居前30位的靶點排序。詳見圖4。從圖中可以看出，148個藥物-疾病靶點可能是整個網絡中的核心，三七-扶芳藤藥對可能是通過這些靶點對心力衰竭起作用。

圖3 靶點相互作用PPI圖

圖4 PPI圖中的靶點排序(排名前30位)

2.5 靶點生物功能及通路分析 將148個共同靶點經R語言運行后GO分析選取生物學過程、細胞組分及分子功能3部分。GO結果顯示，交集基因集合共富集至2 243條生物學過程通路中(見圖5)，其中，富集基因數>10個(富集度>20%)為428條，主要與對細胞外刺激的反應、對脂多糖反應的營養水平的反應、對類固醇激素的反應、活性氧代謝過程、體液水平的調節相關等；交集基因集合共富集至73條細胞組分表達過程中(見圖6)，其中，富集基因數目>10個(富集度>20%)為24條，主要與膜筏、膜微區、膜區域、卡維多拉、質膜筏、囊泡腔細胞外基質、細胞質囊泡腔分泌顆粒腔等有關；交集基因集合共富集至 156個與分子功能相關的過程中(見圖7)，其中，富集基因數目>10個(富集度>20%)為26項，主要與細胞因子受體結合、類固醇結合、內肽酶活性、輔因子結合、細胞因子活性、受體配體活性、絲氨酸水解酶活性等有關。

圖5 三七-扶芳藤藥對GO富集分析的生物過程條形圖

圖6 三七-扶芳藤藥對GO富集分析的細胞組分條形圖

圖7 三七-扶芳藤藥對GO富集分析的分子功能條形圖

將148個共同靶點經R語言運行后共得到144條KEGG通路，前30條的結果形成KEGG功能富集的條形圖，P代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。結果顯示共同靶點主要富集于如AGE-RAGE通路、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路、兩面神激酶-信號傳導及轉錄激活蛋白(JAK-STAT)通路、胞內磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路等。詳見圖8。

圖8 三七-扶芳藤藥對治療心力衰竭的KEGG富集分析

3 討 論

本研究基于網絡藥理學手段，通過對三七-扶芳藤藥對進行成分、靶點與疾病的生物信息學綜合網絡構建，探究三七-扶芳藤藥對治療心力衰竭的整體機制，呈現出中藥治療的多成分、多靶點、整合調節的特點，并進一步通過網絡分析揭示具核心作用通路。

通過整合網絡藥理學分析和實驗室報道，發現三七-扶芳藤藥對的主要化學成分包含人參皂苷Rb1(Gs-Rb1)、槲皮素、β-谷甾醇、兒茶素、沒食子酸等[7-8]，部分關鍵化合物分子具有高度的中心性，并且應用于心血管領域的研究中。相關研究表明，人參皂苷Rb1可在AMPK信號級聯介導下減輕心肌細胞的缺血缺氧損傷[9]。李龍飛等[10]研究發現，人參皂苷Rb1可以阻止阿霉素引起的心肌細胞活力降低，還能夠減少阿霉素誘導的心肌細胞自噬，人參皂苷Rb1對阿霉素誘導心肌細胞死亡的保護作用可能是通過調節心肌細胞自噬而實現的。槲皮素(quercetin)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等廣泛生理活性[11]，已被證明可以減少動脈粥樣硬化病變的形成[12]。β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗腫瘤等功效，研究表明，β-谷甾醇可以降低膽固醇小腸吸收，還能通過抑制膽固醇合成酶(HMG-CoA)的表達，減少膽固醇的體內合成，是治療高膽固醇血癥的有效藥劑[13-15]。研究表明，兒茶素可緩解大鼠心力衰竭，其作用機制可能通過競爭磷酸二酯酶(PEDs)的活性位點，使 PEDs 的催化活性降低而產生催化延遲效應，而且可以抑制心肌細胞凋亡，從而起到緩解心力衰竭的作用[16]。卜麗梅等[17]研究表明，沒食子酸可明顯降低血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平，縮小心肌梗死區范圍，對大鼠實驗性缺血/再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與沒食子酸分別下調促凋亡基因Bax和上調抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表達降低心肌細胞的凋亡有關。這些關鍵化合物在炎癥反應、抗氧化、改善血流灌注、調節血管內皮功能、抑制心肌細胞凋亡及調節心肌細胞自噬等方面均有一定的作用，與三七-扶芳藤藥對前期功效的研究結論有一定契合性。現代醫學認為，心室重構是導致心力衰竭不斷進展的生理病理基礎[18]。心肌細胞肥大、炎癥反應和心臟纖維化是心室重構相關的主要病理變化，心室重構引起心肌細胞自噬水平變化，提高自噬可以抑制心肌重構及心肌肥厚，對自噬信號通路及調控機制的研究將是治療心力衰竭非常有前景的策略。

本研究通過分析篩選出三七-扶芳藤藥對的有效活性成分、作用靶點、信號通路，構建與心力衰竭相關的PPI網絡，用以分析三七-扶芳藤藥對治療心力衰竭的潛在作用機制。根據藥物-疾病-成分網絡圖，三七-扶芳藤藥對各成分通過包括PTGS1、MMP-3、STAT1、VEGFA、AKT1、CRP、IL-6、MMP-9、FOS等多種靶點協同作用，最終達到治療心力衰竭的作用。賈彩霞等[19]通過網絡藥理學分析發現PTGS1與炎癥、細胞凋亡相關，能夠降低血清促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)的水平，明顯改善心功能。孫奇林等[20]研究發現MMP-3屬于細胞外基質金屬蛋白酶，通過藥物干預降低MMP-3的表達達到延緩心肌纖維化的作用。IL-6可通過抑制一氧化氮(NO)合成能力直接影響心臟的收縮能力。馬偉利等[21]研究發現，通過藥物降低IL-6水平可提高心肌收縮力，改善心功能，減輕心臟的氧化應激反應，延緩心室重構進程，從而有效治療心力衰竭。研究表明，VEGFA對血管內皮具有保護作用[22]，VEGFA為冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化治療的新方案，VEGFA可通過調節大鼠的自噬水平，從而改善心功能[23]。MMP-9可促進Ⅰ型膠原水平(ICTP)降解，致使室壁壓力增加、室壁變薄，心肌壞死致使其正常張力喪失，在室壁壓力下心肌重新排列，最終導致心室重構[24]。

通過KEGG富集分析，三七-扶芳藤藥對可能通過AGE-RAGE通路、AMPK通路、JAK-STAT通路、PI3K-AKT通路等多條通路發揮作用。AMPK是細胞的“代謝和能量感受器”[25]，AMPK 介導的信號級聯反應是調節自噬的重要通路之一，AMPK 可感知細胞能量狀態并調節能量穩態，通過線粒體自噬保護心肌細胞免受缺氧誘導的損傷[26]。自噬在能量代謝和蛋白質質量控制中起關鍵作用，且已發現其在病理狀態下有益于心臟功能的恢復[27]。人參皂苷Rb1可能通過 AMPK 信號通路介導缺氧誘導的自噬作用進而調控缺氧心肌細胞的耐缺氧能力[9]。發生心力衰竭或心律失常時，AMPK 的表達在心臟代謝功能障礙中發揮重要作用[28]。研究表明，JAK-STAT通路能夠調節細胞增殖、分化、炎癥和凋亡[29]；曾勇等[30]研究發現中藥可以通過抑制JAK-STAT通路的激活，減輕細胞凋亡，改善心功能。PI3K-AKT信號通路也對心肌細胞凋亡具有抑制作用；王萌等[31]發現激活PI3K/AKT信號轉導通路，可以抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞，抑制心室重構，控制心力衰竭的進展。

網絡藥理學是基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡綜合考察藥物對疾病網絡的干預與影響，提示中藥相關藥理作用靶點、篩選中藥有效靶成分可大大減少實驗工作量，降低重要新藥開發及研究的風險，有助于加速中藥現代化及源于中藥的創新藥物發現[32]。中藥對心力衰竭自噬的調控作用可能為促進，也可能為抑制，中藥治療疾病的機制是復雜交互的網絡而并非單獨起作用，因其多成分、多靶點、多途徑的作用特點，調控細胞自噬機制復雜，可能涉及多條通路、多個靶蛋白。中藥的抗病機制有待豐富，有關中藥調控自噬的物質基礎及機制也有待更深入的研究。隨著自噬相關機制進一步研究，中藥對自噬的調控有望成為治療心力衰竭的新思路和新途徑。本研究初步預測了三七-扶芳藤藥對治療心力衰竭的基本藥理基礎及功效機制，與現代臨床用藥規律契合，為下一步深入驗證奠定了良好理論基礎。