微生物電合成生產中鏈脂肪酸的基本原理及研究進展

褚娜 蔣永 曾建雄

（福建農林大學，福州 350002）

化石燃料的開采使用帶來經濟的高速發展，但是化石燃料儲量有限，并造成人為CO2排放等環境問題［1］。利用清潔能源驅動CO2催化轉化為有機化合物可實現清潔能源的有效開發和儲存，并降低CO2排放。微生物電合成（microbial electrosynthesis，MES）能夠利用電極提供還原力驅動微生物將CO2還原為多碳、胞外有機化合物［2］。MES技術發明于2009-2010年，國內MES技術研究發展基本與國際同步。2009年，黃霞課題組報道在光照下，生物陰極能夠固定CO2產生生物質［3］；同年，成少安教授報道基于混菌的生物陰極能夠還原CO2產生甲烷［4］。2010年，Lovley課題組研究表明產乙酸菌Sporomusa ovata能夠從石墨電極獲得電子將CO2還原為乙酸，并正式定義了微生物電合成技術［5］。2012年，May課題組和李大平課題組分別報道基于混菌的生物陰極可以還原CO2產生乙酸以及甲烷［6］，并探究了陰極電位對產物的影響［7］。在電化學促進有機物的微生物轉化方面，2013年Rabaey課題組發現電流作用下，微生物轉化甘油時通過碳鏈延長產生戊酸［8］。

中鏈脂肪酸（medium-chain fatty acids，MCFAs）是指由6-12個碳原子構成的一元飽和羧酸，包括己酸（C6H12O2）、庚酸（C7H14O2）、辛酸（C8H16O2）、壬酸（C9H18O2）、癸酸（C10H20O2）、十一酸（C11H22O2）和十二酸（C12H24O2）。與短鏈脂肪酸（如乙酸：0.60$/kg［9］）相比，MCFAs具有更高的市場價值（如己酸：3.82 $/kg［9］），以及更強的疏水性（如己酸：10.82 g/L，而癸酸、十一酸和十二酸幾乎不溶于水［10］），因此MCFAs的分離成本更低。MCFAs是重要的化工原料和農用產品，能夠制造抗菌劑、潤滑油和香料，并應用于畜禽產品的防腐保鮮［11］。

MCFAs的傳統產生方法主要依靠石油衍生物或生物質提取［12］。石油衍生物途徑污染嚴重且不可持續；生物質提取途徑來源有限且濃度較低（如椰子和棕櫚仁等提取的MCFAs占總脂肪酸的7.9%-15%［13］）。因此，探究無污染、可持續途徑高效產生MCFAs至關重要。微生物生產MCFAs主要包括有機廢棄物厭氧發酵以及MES催化轉化C1廢氣兩種方法，其中，厭氧發酵中的有機廢棄物主要包括城市固體廢棄物［14］、污泥發酵液［15］、餐廚垃圾［16］、釀酒廢水［17］等，MES中的C1廢氣主要是和合成氣［19］。

MES催化轉化CO2生產MCFAs的原理如圖1所示，即MES轉化CO2為乙酸和乙醇，再利用這些中間產物二次發酵（secondary fermentation），即進行碳鏈延長（chain elongation）產生MCFAs。MES生產MCFAs可望獲得比傳統有機廢棄物厭氧發酵途徑更高的能量效率：MES中可再生能源直接用于捕獲并轉化CO2；而厭氧發酵途徑通過固定CO2形成生物質，再轉化生物質獲得目標產物。此外，MCFAs的能量密度、價格均高于甲烷和乙酸等MES常見產物，MES生產MCFAs可望推進MES技術的實用化。

圖1 MES耦合二次發酵過程產生MCFAsFig.1 MES coupled with secondary fermentation for producing MCFAs

現有綜述多介紹MES產生甲烷或乙酸的相關微生物、電子傳遞或調控方法［20-22］。本綜述通過總結MES催化轉化C1廢氣并耦合二次發酵過程進行碳鏈延長產生MCFAs的研究現狀，分析主要代謝路徑及涉及的功能微生物、電極材料和關鍵運行參數，探討MES特異性產生MCFAs的有效策略。

1 代謝路徑及功能微生物

1.1 代謝路徑

MES轉化CO2產生MCFAs的主要代謝路徑如圖2所示：首先通過還原性乙酰輔酶A途徑（Wood-Ljungdahl pathway，WLP）產生乙酰輔酶A；進而產生乙酸和乙醇；最后通過逆β氧化途徑（reversed β-oxidation，R-Box）產生 MCFAs［13］。

每個R-Box周期，乙酰輔酶A均會偶聯其他輔酶A衍生物經過一系列反應形成增加兩個碳的新輔酶A衍生物（圖2-B）［23］。在乙酸增長為丁酸的逆β氧化周期，乙酰輔酶A偶聯另一個乙酰輔酶A在乙酰乙酰輔酶A硫解酶的作用下生成乙酰乙酰輔酶A。在一系列酶促反應下生成丁酰輔酶A，乙酸輔酶A轉移酶催化丁酰輔酶A的輔酶A轉移到乙酸上形成乙酰輔酶A，進而產生丁酸。電子供體氧化階段生成的乙酰輔酶A與本次逆β氧化形成的丁酰輔酶A作用形成已酰輔酶A，開始丁酸增長為己酸的逆β氧化周期［23］。以此類推，乙酸能夠增長為丁酸、己酸、辛酸、癸酸和十二酸，而丙酸則能夠增長為戊酸、庚酸、壬酸和十一酸。

圖2 乙酸和乙醇產生路徑(A) 和逆β氧化循環(B)［23-24］Fig.2 Pathway for producing acetate and ethanol(A), the reverse β oxidation(B)［23-24］

1.2 功能微生物

MES通過產乙酸菌與碳鏈延長菌協同作用產生MCFAs，所涉及的主要功能微生物如表1所示。目前，已經分離出100多種產乙酸菌［25］。在MES中，多種產乙酸菌（純菌和混菌）均能夠從陰極獲得電子轉化 CO2產生乙酸［22］，如 Acetobacterium、Sulfurospirillum和Desulfovibrio等均能夠利用電子產生乙酸［18，26-27］。純培養實驗表明多種產乙酸菌，包括Sporomusa ovata［5］、Clostridium ljungdahlii 和 Clostridium aceticum 及 Moorella thermoacetica［2］可從陰極獲取電子產生乙酸。共培養實驗表明硫酸鹽還原菌Desulfopila corrodens能夠利用陰極產生的電子以及氫氣作為中介體，而Acetobacterium woodii消耗產生的氫氣形成乙酸［28］。多種產乙酸菌，如Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahlii和 Clostridium ragsdalei等均能夠利用CO2和H2為底物產生乙醇［29］。Clostridium thermoaceticum能夠還原乙酸為乙醇［30］，Thermoanaerobacter pseudoethanolicus能 還 原有機酸為對應的醇［31］，Thermoanaerobacter ethanolicus利用乙酸產生乙醇［32］。

厭氧發酵產生MCFAs主要使用乙醇和乳酸兩種電子供體，而MES產生MCFAs尚未見乳酸作為電子供體的報道。野生型Clostridium spp.的純菌能夠進行碳鏈延長產生MCFAs，如Clostridium kluyveri和Clostridium sp.BS-1［33］等。野生型菌株 Clostridium kluyveri是脂肪酸產生和氧化的模式微生物［34］，能夠利用實際廢棄有機物，比如合成氣發酵液（主要成分為乙酸和乙醇）作為底物高效生產MCFAs［35］。Clostridium sp.BS-1能夠利用多種有機物（如葡萄糖、淀粉等）作為底物，進行碳鏈延長產生MCFAs［36］。混菌具有操作步驟簡單，不需要滅菌等優點。MES使用混菌生產高附加值產物，受到環境工程領域學者的廣泛關注。Clostridium spp.是利用復雜底物產生MCFAs的重要微生物，如利用啤酒［37］、中國黃水［38］等進行發酵。Clostridium_sensu_stricto是產生己酸的關鍵微生物，能夠利用乙醇作為電子供體進行碳鏈延長［17］。許多研究表明，Clostridium spp.是MES碳鏈延長產生MCFAs的優勢菌群。在MES中，使用Clostridium spp.為優勢菌的混菌能夠實現同時產酸、產醇以及碳鏈延長產生MCFAs［39］。在MES中，使用混菌以CO2為底物進行碳鏈延長時，發現Clostridium spp.是生物膜以及懸浮微生物中的優勢菌群［18］；以乙酸鹽為底物時，發現Clostridium spp.作為優勢菌的混菌能夠進行碳鏈延長產生MCFAs［40］。

從胞外固相載體（通電電極以及共生或互生微生物菌群領域的微生物細胞等）中攝取胞外電子的親電微生物（electroautotrophic microorganisms）是MES的核心微生物，親電微生物的電子攝取能力和代謝特性直接影響MES產生MCFAs的能量轉換效率［41］，而功能菌的富集能夠提高反應器性能［42］。表1中MES產生MCFAs涉及的微生物是否為親電微生物，或者與親電微生物的互作關系還有待研究。因此，在MES中優化親電微生物與碳鏈延長微生物的種群結構和空間分布，有望實現MES高效產生MCFAs。

注：-：未報道數據；a：依據MCFAs的電子產生與底物以及電極的電子消耗計算； b：液體產品中MCFAs的電子回收率Note: -: Not available.a: Calculated based on the electron recovery in MCFAs and the electron consumption donated from substrate andelectrode.b: Calculated basedonelectronrecovery in MCFAs andall identified liquid chemicals.

2 電極材料及反應器結構

在MES產生MCFAs的過程中，電極材料以及反應器構型設計對于提高產物生成效率至關重要。構建新型MES反應器以連續運行，增強傳質和電子傳遞，有利于進一步評估MES產生MCFAs的性能。

MES中微生物以CO2為底物從陰極獲取電子產生化學品，不同陰極材料下的產物產生效率不同［48］。例如，中空纖維膜陰極是極具潛力的陰極材料，有利于促進氣體傳質和觸發界面電化學反應［49］。復合陰極材料能夠增強生物電化學還原CO2性能（圖3-A），并且提高乙酸產生濃度［50］。以上陰極材料均已成功應用于MES以提高乙酸產生效率，但是微生物合成MCFAs的步驟更為復雜，以上陰極材料能否促進MES產生MCFAs還有待研究。如表1所示，反應器在不同電極材料下產生MCFAs的性能不同。反應器構型優化有望促進電子傳遞以及增加產物產生速率，加速產物分離以及產品回收。如圖3-B所示［51］，連續攪拌反應器能夠促進傳質以及出水循環，升流式反應器有利于微生物保持懸浮狀態，反應器三室結構方便產物提取與分離等。因此，使用新型陰極材料以及反應器構型進行有效的生物反應器設計，提高產物產生效率的同時促進產物選擇性分離，有望促進MES高效產生MCFAs。

圖3 不同（A）電極材料［50］，（B）反應器構型［51］用于MESFig.3 Electrode materials［50］and reactor configurations［51］used in MES

3 關鍵運行參數

關鍵運行參數（電子供體和電子受體負荷、電極電勢、pH和氣體分壓等）影響微生物催化劑的組成及活性，進而對MES產生MCFAs帶來影響。如何綜合調控MES的關鍵運行參數，實現高速轉化CO2合成MCFAs，尚需深入研究。

3.1 電子供體和電子受體

電子供體和電子受體直接影響MES產生MCFAs。在MES碳鏈延長過程中，僅以CO2為電子受體，以電極為電子供體時，MCFAs的延滯期較長，且產物產生速率較低［18，43］（表1）。與效率低的H2或電極相比，乙醇被認為是最適合碳鏈延長的電子供體之一［23］。在MES轉化CO2的過程中，加入乙醇電子供體，明顯增加MCFAs選擇性以及最大MCFAs產量，最終MCFAs濃度達到7.66 g/L［45］（表1）。研究表明，乙醇和氫氣的電子供體組合比單獨使用乙醇產生MCFAs的濃度更高［52］。當CO作為電子供體時，加入乙酸或丁酸電子受體能夠提高MCFAs產量［53］。

在設定的乙醇和乙酸比例中，乙醇與乙酸比例越高越有利于產生辛酸鹽［54］。當初始乙醇濃度為 28.8 g COD/L（0.3 mol/L，13.82 g/L）時， 抑 制MCFAs產生；而且乙醇/乙酸底物比例越高，微生物碳鏈延長產生辛酸/己酸的比例越高［55］。CO2/CO比例［19］以及 CO2/H2比例［23］能夠影響 MCFAs的產物選擇性。因此，通過調控多種電子供體（電極、H2、CO和乙醇等）和電子受體（CO2、甲酸和乙酸等）的組合及比例，有利于促進MES產生目標MCFAs。

3.2 電極電勢

電極作為MES中的固體電子供體，陰極的電極電勢對微生物代謝具有較大影響［56］。成少安教授［4］發現陰極電位低于-0.700 V（本文出現的電極電勢均相對于Ag/AgCl參比電極）時，微生物能夠還原CO2為甲烷。李大平課題組以CO2為底物，MES的陰極電位在-0.850 V到-0.950 V之間時，只產生CH4和H2；而當陰極電位低于-0.950 V時，主要產物為CH4和乙酸［7］。有研究在-1.0 V電位下進行MES，微生物轉化CO2主要產生乙酸［57］。在-1.047 V的陰極電位下，MES使用生物膜以連續流模式運行能夠轉化CO2產生 MCFAs［43］；增加 CO2加載速率以及水力停留時間能夠增強丁酸和己酸的產物選擇性［44］。

MES中，電極電勢會影響多種反應參數，如氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）環境和析氫速率等，并對氣體分壓以及陰極液pH帶來顯著影響。電極電勢能夠影響微生物和電極的電子交換能力［46］。電極電勢對MES產生MCFAs的具體影響及調控機制還有待研究。

3.3 氣體分壓

不同氣體分壓對MES合成MCFAs過程均有一定影響。CO2分壓影響自養微生物的固碳速率和異養微生物轉化短鏈脂肪酸的效率［58］，H2分壓影響自養微生物與電極間的電子傳遞過程和異養微生物的乙醇氧化副反應［59］，CO分壓影響CO對不同種類微生物的毒性［60］。

CO2/CO比例主要通過不同氣體底物供應速率或者使用不同電化學特性的陰極材料進行調節。研究表明高CO2負載率與長水力停留時間相結合，能夠刺激碳鏈延長產生丁酸和己酸［44］。CO具有毒性，當CO分壓高于0.11 atm時，對產甲烷抑制作用明顯高于對產酸或者產醇的抑制作用［60］。在產生乙酸過程中，增加CO氣體組分，混菌微生物群落比純菌靈敏性低，但是在長期運行過程中主要產物從乙酸轉為乙醇［61］，而乙醇與乙酸的比例會影響產生的辛酸鹽和己酸鹽的比例［56］。CO占比從8%增加到30%，促進乙醇發酵產生己酸［60］；研究表明CO2/CO比例為1∶1時，己酸選擇性最高［19］。

在MES中，H2的原位產生和迅速消耗是實現陰極和微生物之間電子轉移的重要途徑［22］，所以H2分壓在實驗過程中通常比較低。因此，在MES中，有望通過調節氣體分壓來調控乙酸和乙醇等中間產物的比例，進而增加目標MCFAs的產量。

3.4 pH

在生物活性范圍內，pH＞6時有利于產生乙酸，pH＜5時有利于產生乙醇［62-63］，pH在4.8左右時，有利于產生高級醇［25］。pH為5.0-5.5時，乙酸和乙醇同時存在，微生物能夠通過逆β氧化途徑進行碳鏈延長產生MCFAs［55］。有研究發現pH為5.5和7時，均能夠產生己酸；而辛酸只在pH為7時產生［52］。構建雙生物陰極的MES，以離子交換膜分割設置不同pH區域，可實現同時產酸、產醇（pH約4.9）以及碳鏈延長產生 MCFAs（pH 約 6.9）［39］（圖4）。

圖4 配備雙生物陰極的MES實現不同pH區域劃分［39］Fig.4 MES equipped with dual biocathodes working at different pH zones［39］

當溶液pH在羧酸的解離常數pKa（4.8-4.9）附近時，溶液中的MCFAs幾乎均為未解離MCFAs；當溶液pH為中性時，未解離MCFAs低于1%［64］。酸性pH下存在未解離MCFAs，而產甲烷菌比碳鏈延長功能菌對未解離MCFAs毒性更敏感［59］，所以酸性pH能夠抑制并減少與碳鏈延長微生物競爭底物的產甲烷菌［65］。已有兩種方法維持低濃度未解離MCFAs：一是在6.5-7.0的中性pH下直接產生MCFAs［66］；二是在5.0-5.5的酸性pH下運行反應器并進行產物提?。?7］。

pH直接影響微生物電化學還原CO2以及碳鏈延長產生MCFAs，而且這兩個過程均可能導致陰極液酸化［18］。與此相反，析氫反應可能致使陰極液堿化，當混菌不能消耗原位產生的H2時會出現陰極液過堿化［67］，進而導致MES產生MCFAs的性能下降。pH能夠通過改變脂肪酸和CO2的解離平衡，影響MES產生產品的分離選擇性。因此，可以通過pH調節來調控MES產生目標MCFAs。

4 MES中復雜底物影響MCFAs生產

研究表明MES能夠利用不同底物進行碳鏈延長產生MCFAs，如表1所示。在MES中，底物選取及其比例對MCFAs產生起著重要作用，有望通過底物選擇以及比例調控促進特異性產生MCFAs。

4.1 C1廢氣

4.1.1 CO2氣體 MES能夠利用CO2為底物直接產生MCFAs（表1）。陰極電勢固定在-0.997 V時，陰極溶解的CO2以及產生的羧酸能夠抵消陰極產生氫氣帶來的陰極液堿化，在長期運行過程中陰極pH能夠保持穩定以利于產生MCFAs，己酸濃度最大達到1.2 g/L［18］。使用廉價的碳氈陰極，在低CO2供應速率（0.09 L/d）以及短水力停留時間（4 d）下產生己酸的濃度最高達到1.5 g/L［43］；而在高CO2加載速率（173 L/d）以及長水力停留時間（14 d）下，己酸濃度最高為3.1 g/L［44］。盡管MES利用CO2產生MCFAs具有環境效益，但是CO2的高氧化電位以及熱力學穩定性，使其以MCFAs作為目標產物時仍表現出低產物選擇性。

4.1.2 合成氣 工業過程（如鋼鐵產業、有機廢物氣化等）中通常產生大量C1廢氣，其組分顯著不同，如在煉鋼過程［68］、生物質氣化過程［69］等產生的合成氣中CO占比為5%-70%。不同CO2/CO比例［19］及CO2/H2比例［23］均會影響MCFAs的產物生成以及產生速率。CO對微生物具有毒性，當CO分壓高于0.11 atm時，明顯抑制產甲烷［60］。CO在生物轉化中能夠同時作為碳源和電子供體［53］。CO/CO2的氧化還原電位（E0′= -520 mV）低，有利于微生物還原其產生醇或丙酮酸衍生物等化學品［70］。合成氣組分以及比例影響MES中MCFAs的產生速率以及選擇性，當CO2/CO合成氣比例為1∶1時，產生MCFAs的選擇性最高［19］。因此，探究MES利用合成氣產生MCFAs，有利于C1廢氣的回收利用，以實現MES利用不同來源的C1廢氣特異性產生MCFAs。

4.2 有機廢棄物

4.2.1 人工合成廢棄物 已有研究表明，在MES中微生物能夠將短鏈脂肪酸延長為MCFAs。例如，MES利用乙酸為底物產生己酸（0.739 g/L）和辛酸（0.036 g/L）［40］。有機酸種類和濃度影響MCFAs的生產。乙酸和丁酸對于正己酸產生至關重要，而異丁酸和乙醇促進異己酸產生［71］。辛酸鹽濃度隨乙醇與乙酸比例增加而升高，己酸鹽產生則相反［54］。使用乙酸和乙醇為底物進行電發酵，新鮮碳氈陰極電發酵比不加電組己酸選擇性增加28%，而富集陰極電發酵的底物濃度與己酸選擇性呈現非線性關系［46］。因此，調節短鏈脂肪酸與醇的種類和比例進行碳鏈延長，有利于選擇性產生目標MCFAs。

4.2.2 實際廢棄物 MES利用有機廢棄物為底物進行碳鏈延長產生MCFAs，需要同時進行水解、初次發酵、碳鏈延長等多重步驟。在MES中，以甘油為底物，對混菌供電時戊酸積累量增加［8］。利用甘油為底物進行電發酵時，不同陰極電位下混菌產生丙酸和丁酸的比例不同［47］。使用不銹鋼網陰極利用釀酒廢水發酵，主要產物從丙酸轉變為戊酸，表明存在碳鏈延長過程［72］。在MES中，置入電極會影響微生物群落的分布和結構。通過有毒產物提取等方法增強微生物和電極的協同作用有利于碳鏈延長。例如，構建膜液液萃取系統，將生物反應器（pH5.5）產生的MCFAs泵入堿性提取液（pH9），再將堿性提取液通入膜電解池的陰極室（pH約9），使陰極液中解離MCFAs通過陰離子交換膜轉移到酸性陽極液（pH約1.5），進而實現液相分離并高效提取MCFAs［73］。盡管目前沒有相關報道，上述研究揭示MES可望提供一種利用有機廢棄物進行碳鏈延長以實現實際廢棄物資源化的新方法。

5 展望

MES是利用C1廢氣以及有機廢棄物產生MCFAs的較有潛力的技術，然而，MES產生MCFAs尚存在一些技術瓶頸。尚需通過菌群優化、調節關鍵運行參數以及使用新型陰極材料等提高其性能。

（1）合成生物學手段以及混菌群落調控可提高生化反應性能。合成生物學使用基因組設計和有效的分子工具，可以廣泛高效地改造功能菌，有望從調控細胞電子傳遞路徑、胞內還原力水平和胞內信號分子的表達等3個方面［74］改造功能菌以實現高效產生MCFAs。對細胞進行材料修飾有望提高MCFAs產率，如使用半導體納米顆粒修飾CO2固定菌［75］，促進陰極CO2還原產生其他高附加值產品?；炀郝湔{控優化功能菌，有望增強菌群相互作用，以提高MES產生MCFAs的性能。電極生物膜的形成可為不同菌群提供最優微環境，增加生物量以及提高體積產率。

（2）尚須綜合優化MES產生MCFAs的關鍵運行參數。綜合調控電子供體和電子受體負荷、電極電勢、氣體分壓和pH等運行參數，控制以C1廢氣或有機廢棄物為底物產生乙酸和乙醇等中間產物的比例，增強微生物和電極的協同作用，能夠促進短鏈脂肪酸和乙醇特異性產生目標MCFAs。

（3）有必要對MES產生MCFAs的長期運行性能進行評估。連續運行MES反應器，促進底物和產物傳質以及胞外電子傳遞；使用同位素標記方法［76］和定量PCR技術對碳鏈延長過程進行研究；建立動力學模型分析碳鏈延長過程中不同路徑的具體貢獻；均有望進一步促進MES高效產生MCFAs。

6 結論

MES利用C1廢氣以及有機廢棄物為底物產生MCFAs，能夠在減少碳排放、處理有機廢棄物的同時將其資源化并轉化為具有較高價值的化合物，具有很高的環境和社會效益。本文總結MES催化轉化C1廢氣并耦合二次發酵過程進行碳鏈延長產生MCFAs的研究現狀，具體如下。

（1）MES研究中多為產乙酸菌與碳鏈延長菌協同作用產生MCFAs：通過WLP產生乙酸和乙醇，并通過R-Box過程產生MCFAs。（2）探索新型陰極材料以及綜合調控MES的關鍵運行參數，有望實現MES高速合成目標MCFAs。（3）探究不同底物的組合及其比例，有望為MES轉化實際廢棄物并特異性產生MCFAs提供指導。