展示犬瘟熱病毒抗原表位的犬細小病毒樣顆粒構建

竇小龍，馬文戈，苗書魁，米曉云 ，盛肖剛 ，魏玉榮 *

（1青島拜特爾生物科技有限公司，山東 青島 266114）

（2新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆 烏魯木齊 830013）

（3新疆動物疫病研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830013）

（4新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，新疆 烏魯木齊 830011）

犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）感染引起的犬瘟熱是一種急性、亞急性、高度接觸性傳染病，犬和肉食目中許多動物都可感染。犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）是引起犬急性出血性胃腸炎和幼犬非化膿性心肌炎的重要病原，可促進腸道細菌易位，并引起嚴重的免疫抑制[1]。臨床上兩種病常常并發或繼發感染，危害嚴重[2]。目前，對CDV及CPV防控主要是以弱毒疫苗免疫預防為主，雖然廣泛應用的弱毒聯苗具有保護力強等優點，但弱毒苗在使用過程中也存在弱毒株毒力返祖、與野毒基因重組加速病毒變異、對某些敏感性動物依然致病等諸多問題，需要開發新型疫苗來彌補這些不足。病毒樣顆粒（virus-like particles,VLPs）可模擬病毒自身特有的結構但不能自我復制，確保了免疫原的安全性及免疫原性，具有良好開發前景[3-5]。

核衣殼蛋白VP2是CPV的主要保護性抗原[6]，在體外表達后可以自我裝配成VLPs[7]。已有研究證明VP2蛋白上某些氨基酸片段缺失或替代并不影響其在體外組裝成VLPs[8]，這使得VP2蛋白可作為外源抗原的載體形成VLPs制備多價抗原。CDV融合蛋白（F）是構成病毒囊膜的主要成分，在病毒感染和致病性方面起著重要作用。麻疹病毒屬成員中CDV、麻疹病毒（measles virus,MV）和牛瘟病毒（rinderpest virus,PRV）群特異性表位主要在F蛋白上，是異型免疫的主要交叉抗原[9]。F蛋白的400-LSEVKGVIVHRLEAVS-415基序是重要的T細胞表位，能誘導CTL活性，516-INQSPDKLLTF-526基序是B細胞抗原表位。基于T細胞表位和B細胞表位的合成肽免疫小鼠后能對MV、CDV的攻擊產生明顯的保護反應[10]。本實驗將CDV F蛋白的B細胞表位插入CPV VP2的氨基端，并用CDV F蛋白的T細胞表位替換CPV VP2蛋白loop 2區域的218-LIPSHTGTS?GTPTNIY-233氨基酸序列，人工合成編碼該融合蛋白的核苷酸序列，并克隆到pET-28a（+）載體上，轉化BL21(DE3)，表達的重組蛋白能組裝成VLPs，且具有良好的免疫原性。本實驗為重組CDV和CPV新型亞單位疫苗的研究提供了新的探索途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞、表達載體及實驗動物

感受態JM109、BL21（DE3）及表達載體pET-28a（+）均由新疆畜牧科學院獸醫研究所病毒研究室保存。BALB/c小鼠購自新疆醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶BamH I、XhoI，T4 DNA Poly?merase，Prestained Protein Ladder購自 Thermo Fisher Scientific；DL15 000DNA Marker購自TakaRa；質粒小提試劑盒（Plasmid Miniprep Kit）購自愛思進生物技術（杭州有限公司）；兔抗犬IgG（Anti-Dog IgG-Perox?idase antibody produced in rabbit）購自SIGMA。206佐劑由新疆畜牧科學院獸醫研究所病毒研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 FB-FT-VP2基因合成及表達質粒的構建

參考CPV VP2蛋白（GenBank ID：ACS50333.1）和CDV F蛋白（GenBank ID：AAK54668.1）序列，選擇CDV F蛋白的B細胞表位516-INQSPDKLLTF-526氨基酸序列融合到CPV VP2蛋白的氨基端，并用CDV F蛋白上的T細胞表位400-LSEVKGVIVHRLEAVS-415氨基酸序列替換CPV VP2蛋白loop 2區域的218-LIPSHTGTS GTPTNIY-233氨基酸序列，融合蛋白氨基酸序列如圖1。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成編碼該融合蛋白的核苷酸序列，并克隆到pET-28a（+）載體上，命名為pET-28a-FBFT-VP2。

圖1 FB-FT-VP2融合蛋白氨基酸序列

1.2.2 融合蛋白的表達

重組質粒pET-28a-FB-FT-VP2經酶切、測序鑒定正確后轉化BL21（DE3）感受態細胞，涂布含50 μg/mL硫酸卡那霉素LB平板，篩選陽性克隆菌株命名為BL21-pET-28a-FB-FT-VP2。接種含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養液，37℃，250 r/min搖床培養至OD600nm為0.6～0.8。加入100 mmol/L的IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃再培養3 h。

1.2.3 融合蛋白SDS-PAGE及Western-blot檢測

取200 μL菌液12 000 r/min離心5 min，沉淀用10 μL PBS重懸，加入2×SDS上樣緩沖液10 μL，經沸水浴處理10 min后取10 μL進行SDS-PAGE電泳及Western-blot檢測。Western-blot檢測時脫脂乳封閉1 h。一抗是CPV陽性血清，37℃孵育1 h。PBS洗滌后加辣根過氧化物酶標記的兔抗犬IgG為二抗，37℃孵育1 h。PBS洗滌后用DAB顯色液顯色。

1.2.4 融合蛋白的包涵體變性、復性及內毒素去除

菌體超聲破碎、離心取沉淀，加入沉淀重量10倍體積含1% Triton X-114的20 mmol Tris-HCl（pH7.4）緩沖液充分懸浮，室溫靜止5 min，12 000 r/min離心5 min，收集沉淀。重復2～3次以充分去除內毒素。按每克原菌體濕重加入6 mol/L尿素溶液2 mL重懸，室溫下作用1 h變性。將變性蛋白液緩緩加入10倍體積的20 mmol Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中，混勻后4℃靜止過夜。12 000 r/min離心5 min收取上清即為復性的FB-FT-VP2融合蛋白。

1.2.5 重組VLPs的透射電鏡檢測

取 FB-FT-VP2融合蛋白液 1 mL，加入 10 μL CPV陽性血清，37℃作用30 min，迅速放置4℃平衡1 h。4℃條件下12 000 r/min離心30 min，棄上清液900 μL，留100 μL上清溶解沉淀作為電鏡樣品，4 ℃條件下送新疆大學理化測試中心電鏡室，醋酸鈾負染色，于H-600透射電鏡下觀察VLPs組裝情況。

1.2.6 融合蛋白的血凝效價測定

96孔微量板從第1孔至12孔，每孔加PBS 25 μL。FB-FT-VP2融合蛋白液25 μL，從第1孔起，依次做2倍系列稀釋，至最后1個孔，棄去25 μL液體。每孔加入0.5%豚鼠紅細胞懸液25 μL，并設不加樣品的紅細胞對照孔，在微量板振蕩器上搖勻，置室溫1 h，當對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。以使紅細胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點。

1.2.7 融合蛋白免疫效果檢測

1.2.7.1 亞單位疫苗配制

取FB-FT-VP2融合蛋白液用生理鹽水稀釋至蛋白濃度為200 μg/mL，與206佐劑1∶1混合乳化。

1.2.7.2 BALB/c小鼠免疫

7周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成2組，每組10只，第一組為試驗組，腹腔注射FB-FT-VP2亞單位疫苗0.1 mL/只（10 μg FB-FT-VP2蛋白），第二組為對照組注射生理鹽水0.1 mL/只。免疫后第21天小鼠尾靜脈采血分離血清。

1.2.7.3 CDV中和抗體檢測

將免疫小鼠血清用不含牛血清的細胞維持液從1∶16作倍比稀釋至1∶128，取 4個稀釋度分別與200 TCID50/0.1 mL的CDV毒液等量混合，另取200 TCID50/0.1 mL的病毒液加入等體積細胞維持液作為病毒對照，置37℃作用1 h，接種Vero細胞單層96孔培養板，每個稀釋度8孔，每孔0.1 mL，同時設對照細胞8孔（只加維持液）。接種后，置5%二氧化碳、37℃條件下培養5 d，觀察CPE，病毒對照細胞孔均應出現CPE，細胞對照孔無CPE，按Reed-Muench法計算血清中和抗體效價。

1.2.7.4 CPV中和抗體檢測

小鼠免疫血清CPV中和抗體檢測方法同

1.2.7.3，所用細胞為F81。

2 結果

2.1 FB-FT-VP2基因合成及表達質粒的鑒定

合成FB-FT-VP2基因共1 788 bp，并將該片段克隆到pET-28a（+）載體上構建pET-28a-FB-FTVP2質粒，經BamHI、XhoI雙酶切鑒定，酶切得到的目的片段為1 788 bp，見圖2。

圖2 pET-28a-FB-FT-VP2的酶切鑒定

2.2 融合蛋白的表達

以BL21（DE3）未轉化菌體蛋白做陰性對照，SDS-PAGE電泳，Western-blot檢測pET-28a-FBFT-VP2轉化菌表達融合蛋白情況。考馬斯亮藍染色，在66 KDa左右出現特異性條帶，見圖3。用CPV陽性血清作一抗，用辣根過氧化物酶標記的兔抗犬抗體作二抗對表達產物進行Western-blot，經DAB顯色液顯色，在66 KDa左右出現特異性條帶，見圖4。結果表明FB-FT-VP2融合蛋白與CPV陽性血清可特異性結合。

圖3 FB-FT-VP2融合蛋白的SDS-PAGE檢測

圖4 FB-FT-VP2融合蛋白的Western-blot檢測

2.3 VLP的透射電鏡檢測

透射電鏡檢測顯示，能觀察到直徑約22 nm大小的VLPs，見圖5。

2.4 融合蛋白的血凝效價測定

FB-FT-VP2融合蛋白液對0.5%豚鼠紅細胞懸液的凝集價為1∶1 024，對照孔中的紅細胞無血凝，呈顯著紐扣狀，見圖6。

圖6 FB-FT-VP2融合蛋白的血凝效價測定

2.5 融合蛋白免疫效果檢測

7周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射FB-FT-VP2亞單位疫苗0.1 mL/只（10 μg FB-FT-VP2蛋白），免疫后第21天尾靜脈采血分離血清。免疫組CDV中和抗體 1∶32（4/10）至 1∶64（6/10）；CPV 中和抗體 1∶64（10/10）。對照組均未檢測到中和抗體。免疫小鼠血清中和后病毒接種細胞與細胞對照相比，細胞無明顯變化，形態基本完整；接種病毒的細胞病變明顯，成團、聚集或脫落。可見免疫小鼠血清中含有效中和抗體，見圖7。

圖7 免疫小鼠血清病毒中和實驗

3 討論

利用VLPs展示外源病原的抗原表位，將外源表位正確折疊且充分暴露于VLPs表面更易于表位與B細胞受體結合，從而誘導高滴度的抗體水平。由于組裝的VLPs能模擬病毒結構，可使VLPs疫苗達到與全病毒相近的免疫效果。CPV疫苗能刺激有效的免疫保護[11-12]。隨著CPV衣殼結構的解析，基于VP2蛋白亞單位疫苗的研究不斷深入。研究者在CPV VLPs制備方面進行了大量研究，借助原核、真核、桿狀病毒及家蠶表達系統表達的CPV的VP2蛋白均可以自組裝成VLPs，重組的VP2 VLPs疫苗，能夠刺激較高的抗體滴度從而保護試驗動物抵抗CPV病毒攻擊[13-16]。CPV VP2蛋白組裝成的VLPs能模擬完整蛋白結構，比單獨的表位疫苗免疫原性好，能夠誘導高水平的體液免疫和細胞免疫。探索在不破壞VP2上自身抗原表位的同時將外源表位正確展示在VLPs表面的多價抗原，免疫動物可以獲得同時抵御CPV及外源病原攻擊的保護，可達到一針多防的效果。

本實驗將CDV F蛋白的B細胞表位插入CPV VP2的氨基端，用CDV F蛋白的T細胞表位替換CPV VP2蛋白loop 2區域的218-LIPSHTGTSGTPTNIY-233氨基酸序列，人工合成編碼該融合蛋白的核苷酸序列，并克隆到pET-28a（+）載體上，轉化BL21(DE3)感受態，成功表達了FB-FT-VP2融合蛋白。表達的重組蛋白純化后能體外組裝成VLPs，透射電鏡可以觀測到約22 nm大小VLPs結構，與天然的CPV粒子大小接近。FB-FT-VP2融合蛋白組成的VLPs具有與天然CPV粒子相似的血凝特性。Western-blot結果證實，該重組融合蛋白具有良好的反應原性。免疫BALB/c小鼠能刺激產生針對于CPV和CDV的中和抗體。本實驗為重組CDV和CPV新型亞單位疫苗的研究提供了新的探索途徑，為犬的多價亞單位疫苗研究奠定了一定的基礎。

4 結論

大腸桿菌表達系統表達的含CDVF基因B、T細胞抗原表位重組CPV VP2蛋白可自我組裝成VLPs，并具有血凝活性，可產生刺激機體中和抗體。基于體外中和實驗，構建的雙價疫苗有望可同時預防犬細小病毒病和犬瘟熱。