蛭龍活血通瘀膠囊拆方組分抗大鼠動脈粥樣硬化及降血脂作用

耿 路，張詩意，廖慧玲

（西南醫科大學中西醫結合學院，四川瀘州 646000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosisi，AS）是一種臨床上常見的血管病變，是諸多缺血性心腦血管疾病共同的病理基礎，是全世界最主要的致死原因之一[1]。迄今為止，有關AS的發病機制已有許多學者各抒己見衍生出許多不同學說，如脂質浸潤、損傷免疫應答、炎性反應及血流動力學學說等[2]，然而AS的病理機制復雜，任意一種學說均不能單獨全面的解釋其完整的發生機制。異常血脂是AS發生發展最重要的因素。大量流行病學資料顯示AS的嚴重程度與血清總膽固醇（total cholesterol，TC）水平呈正相關，低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高是AS 重要的病理基礎，在血脂異常中扮演重要角色[3]。而高密度脂蛋白膽固醇（high-den?sity lipoprotein cholesterol，HDL-C）是AS 的保護因素，有益于心血管，升高HDL-C水平可作為抗AS的治療靶點[4]。因此降低血清TC、LDL-C，升高HDL-C對防治AS有積極意義，且大量臨床研究表明中醫藥在心腦血管疾病防治方面具有獨特優勢。

蛭龍活血通瘀膠囊是本院楊思進教授結合中醫藥理論及多年臨床經驗總結研發的院內制劑，由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝組成，具有化痰通絡、益氣活血的功效。前期工作表明其具有良好的抗AS作用[5]，但對蛭龍活血通瘀膠囊拆方組分防治AS 的研究尚未涉及。本實驗通過制備大鼠AS 模型，觀察了蛭龍活血通瘀膠囊及其拆方對AS大鼠血脂四項、主動脈病理形態學及內膜厚度的影響，篩選出其抗AS的主要藥味，精簡組方，探討其作用機制，并為該藥臨床廣泛應用于防治AS提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康雄性SD 大鼠110 只，體重（200 ±10）g，西南醫科大學實驗中心提供。所有實驗操作均獲得西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物

蛭龍活血通瘀膠囊組成（免煎顆粒）：黃芪（每袋裝1.1 g）、桂枝（每袋裝0.3 g）、大血藤（每袋裝0.6 g）、地龍（每袋裝1.0 g）、水蛭（每袋裝0.3 g），均購自四川新綠色藥業科技公司。阿托伐他汀鈣10 mg/片，維生素D3注射液7.5 mg/mL，丙硫氧嘧啶50 mg/片等。

1.3 實驗試劑與耗材

膽酸鈉、膽固醇、卵清蛋白、牛血清蛋白、多聚甲醛、無菌注射器、灌胃針、手套、口罩、生理鹽水等。

1.4 實驗儀器

高溫低速離心機、正置熒光顯微鏡、Leica 切片機、生物組織包埋機、全自動生化分析儀、病理圖像采集成像系統等。

1.5 實驗方法

1.5.1 正交設計分組 本實驗主要研究蛭龍活血通瘀膠囊中黃芪（A）、桂枝（B）、大血藤（C）、地龍（D）、水蛭（E）這五味組成藥物，拆方組用這五個因素，取“用藥”“不用藥”水平，分別以“1”和“0”表示，采用正交設計表設計出拆方1～7號方（表1）。

表1 蛭龍活血通瘀膠囊正交設計表

將適應性喂養1周后的健康清潔級SD大鼠110只隨機分為空白組、模型組、阿托伐他汀組、全方組、拆方1～7 號組，每組10 只，每籠5 只。

1.5.2 建立模型 參照張安邦等[6]探索的復合方法制備SD大鼠AS模型。各組大鼠飼養120 d后取材。

1.5.3 藥物干預 造模60 d后，藥物干預組予以不同藥物干預，各藥物等效劑量換算按照原方體重為60 kg 成人劑量的6.17 倍的計算比例[7]，各組按照10 mL·kg-1·d-1的量予以懸液[8]，每日灌服1次，持續60 d。

1.5.4 取材及檢測指標 末次給藥后，采集腹主動脈約5 mL 血液，于離心機中以3000 rpm/min 離心10 min，分離血清。生化分析法檢測TC、甘油三酯（tri?glyceride，TG）、LDL-C、HDL-C的含量。

取血后，剪取約2 cm 長的胸主動脈，清理附著組織，生理鹽水沖洗后用4%甲醛固定24 h，制作病理切片，經HE 染色后，在光鏡下觀察胸主動脈形態學變化，隨機選取四個視野，用IPP 6.0 圖像分析系統測量胸主動脈內膜厚度（IT）。

1.5.5 統計學分析 使用IBM SPSS 21.0統計軟件進行分析，本實驗所有計量資料均以均數±標準差（）表示，正交試驗結果通過直觀和方差分析法進行分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物對AS大鼠血清血脂四項的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C值明顯升高，HDL-C 值明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，除拆6、7號組外，余各藥物組的大鼠血清TG、TC、LDL-C值均明顯降低，HDL-C 值均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），模型組與拆6、7 號組相比血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 值差異無統計學意義（P ＞0.05）；蛭龍活血通瘀膠囊全方組（即全方組）與各拆方組相比，血清TG、TC、LDL-C值均明顯降低，HDL-C值明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；拆2 號組與余各拆方組相比，血清TG、TC、LDL-C值均明顯降低，HDL-C 值明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；同理，拆1 號組與剩余各拆方組相比，大鼠血清TG、TC、LDL-C 值均明顯降低，HDL-C 值明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；拆3 號組與拆4、5號組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值無明顯差異（P ＞0.05），而拆3號組與拆6、7號組相比，其大鼠血清TG、TC、LDL-C 值均明顯降低，HDL-C 值明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；拆6 號組與拆7 號組相比較，血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 值無明顯差異（P ＞0.05）。全方組與阿托伐他汀組相比，血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 值無明顯差異（P ＞0.05）；各拆方組與阿托伐他汀組相比，大鼠血清TG、TC、LDL-C值均明顯升高，HDL-C值均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2、3。

表2 各組大鼠血清TC、TG值的比較（n=10，mmol/L，）

表2 各組大鼠血清TC、TG值的比較（n=10，mmol/L，）

注：a 與空白組比較P＜0.05；b 與模型組比較P＜0.05；c與阿托伐他汀組比較P＜0.05；d與全方組比較P＜0.05；e與拆1號組比較P＜0.05；f與拆2號組比較P＜0.05；g與拆3號組比較P＜0.05；h與拆4號組比較P＜0.05；i與拆5號組比較P＜0.05；j與拆6 號組比較P＜0.05；k與拆7號組比較P＜0.05

表3 各組大鼠血清LDL-C、HDL-C值的比較（n=10，mmol/L，）

表3 各組大鼠血清LDL-C、HDL-C值的比較（n=10，mmol/L，）

注：a與空白組比較P＜0.05；b與模型組比較P＜0.05；c與阿托伐他汀組比較P＜0.05；d與全方組比較P＜0.05；e與拆1號組比較P＜0.05；f與拆2號組比較P＜0.05；g與拆3號組比較P＜0.05；h 與拆4 號組比較P＜0.05；i 與拆5 號組比較P＜0.05；j 與拆6 號組比較比較P＜0.05；k 與拆7 號組比較P＜0.05

2.2 藥物對AS 大鼠血清血脂四項影響的正交實驗結果

取各組大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C 值的平均值，根據正交設計表分別計算各列K 值和R 值，K 值表示各藥物組分采用或不采用時血脂指標的平均值，R 值的大小反應各藥物成分對血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值影響的大小。

根據計算血清TC、LDL-C 的R 值，TC：R黃芪為1.44，R桂枝為0.67，R大血藤為0.2，R地龍為0.65，R水蛭為0.65；LDL-C：R黃芪為0.83，R桂枝為0.47，R大血藤為0.08，R地龍為0.31，R水蛭為0.31，排列出各因素對血清TC及LDL-C 值影響的大小順序均是黃芪＞桂枝＞地龍=水蛭＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中發揮降低血清TC、LDL-C 作用的藥味主要是黃芪、地龍、水蛭、桂枝。據方差結果顯示證實這一結果：全方中黃芪明顯降低血清TC、LDL-C 值（P＜0.01），桂枝、水蛭、地龍降低血清TC、LDL-C 值作用較黃芪弱（P＜0.05），而大血藤無明顯降低血清TC、LDL-C 值作用（P ＞0.05）。

同理計算血清TG 的R 值，R黃芪為0.83，R桂枝為0.39，R大血藤為0.09，R地龍為0.25，R水蛭為0.29，排列出各因素對血清TG 值影響的大小順序是黃芪＞桂枝＞水蛭＞地龍＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中發揮降低血清TG作用的藥味主要是黃芪、水蛭、地龍、桂枝。據方差結果顯示證實這一結果：全方中黃芪明顯降低血清TG 值（P＜0.01），桂枝、水蛭、地龍降低血清TG 值作用較黃芪弱（P＜0.05），而大血藤無明顯降低血清TG值作用（P ＞0.05）。

同理計算血清HDL-C 的R 值，R黃芪為0.38，R桂枝為0.22，R大血藤為0.03，R地龍為0.2，R水蛭為0.22，排列出各因素對血清HDL-C 值影響的大小順序是黃芪＞桂枝=水蛭＞地龍＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中發揮升高血清HDL-C作用的藥味主要是黃芪、水蛭、地龍、桂枝。據方差結果顯示證實這一結果：全方中黃芪、桂枝、地龍、水蛭明顯升高血清HDL-C 值（P＜0.01），而大血藤無明顯升高血清HDL-C 值作用（P ＞0.05）。

2.3 藥物對AS大鼠胸主動脈形態學的影響

觀察光鏡下組織切片，空白組：正常主動脈血管壁，內膜無脂質沉積，各層結構清晰，少量平滑肌纖維及膠原纖維穿插其中，細胞排列正常，彈力纖維分布均勻，無泡沫細胞及纖維化等病理改變。模型組：動脈血管壁凹凸不平，內膜增厚、水腫向腔內凸起，內皮下可見大量泡沫細胞及脂質沉積，少許炎性細胞浸潤，平滑肌萎縮，排列紊亂，中膜部分細胞結構消失，彈力纖維斷裂，外膜可見少許結締組織增生，形成典型的動脈粥樣硬化斑塊。與空白組比較，模型組的AS 病變明顯。除拆方6 號組、拆方7 號組外，各藥物組的病變程度較模型組輕，能不同程度的抑制AS 進展，保護血管內皮結構，其作用主要表現在減少炎性因子生成，抑制泡沫細胞的形成、聚集及脂質沉積，保護平滑肌細胞正常結構，抑制纖維化等。其中對胸主動脈形態學改變保護作用最佳的藥物組是阿托伐他汀組和全方組，而拆方6 號組、拆方7 號組對大鼠胸主動脈形態學保護作用不明顯，且拆方2號組優于余各拆方組。（見圖1）

圖1 各組大鼠胸主動脈病理形態學結果（HE染色，× 400）

2.4 藥物對AS大鼠胸主動脈內膜厚度的影響

2.4.1 各組大鼠胸主動脈內膜厚度的比較 各組大鼠胸主動脈內膜厚度用圖像分析儀檢測，模型組較空白組內膜增厚明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）；除拆6、7 號組之外的其他藥物干預組比模型組內膜明顯變薄，差異具有統計學意義（P＜0.05）；拆6、7號組與模型組相比內膜厚度無明顯差異（P ＞0.05）。與相比，各拆方組內膜較阿托伐他汀組明顯增厚，差異具有統計學意義（P＜0.05）。阿托伐他汀組與全方組內膜厚度差異無統計學意義（P ＞0.05）。與全方組相比，各拆方組內膜明顯增厚，差異具有統計學意義（P＜0.05）；拆方組中，拆2 號組內膜厚度較其他拆方組明顯變薄，差異具有統計學意義（P＜0.05）。拆1號組較拆3、6、7號組內膜明顯變薄，差異具有統計學意義（P＜0.05），拆1 號組與拆4、5 號組的內膜厚度無明顯差異（P ＞0.05）。拆3號組的內膜厚度較拆6、7 號組明顯變薄，差異具有統計學意義（P＜0.05）；拆6 號組和拆7 號組之間差異無統計學意義（P ＞0.05）。（見表4，圖2）

圖2 各組大鼠胸主動脈內膜厚度比較（，μm）

表4 各組大鼠胸主動脈內膜厚度比較（n=10，μm，）

表4 各組大鼠胸主動脈內膜厚度比較（n=10，μm，）

注：a與空白組比較P＜0.05；b與模型組比較P＜0.05；c與阿托伐他汀組比較P＜0.05；d與全方組比較P＜0.05；e與拆方1 號組比較P＜0.05；f 與拆方2 號組比較P＜0.05；g 與拆方3號組比較P＜0.05；h與拆4號組比較P＜0.05；i與拆5號組比較P＜0.05；j 與拆6 比較P＜0.05；k 與拆7 比較P＜0.05

2.4.2 藥物對大鼠胸主動脈內膜厚度影響的正交試驗結果 取各組大鼠胸主動脈內膜厚度的平均值分析，根據正交設計表計算各列K 值和R 值，K 值表示各藥物組分采用或不采用時大鼠胸主動脈內膜厚度的平均值，R 值的大小表示各藥物成分對大鼠胸主動脈內膜厚度影響的大小。

計算大鼠胸主動脈內膜厚度的R 值，R黃芪為11.48，R桂枝為8.10，R大血藤為2.8，R地龍為8.00，R水蛭為8.92，排列出各因素對大鼠胸主動脈內膜厚度值影響的大小順序：黃芪＞水蛭＞桂枝＞地龍＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中黃芪、地龍、水蛭、桂枝發揮使大鼠胸主動脈內膜變薄作用。據方差結果顯示證實這一結果：全方中黃芪、地龍、水蛭、桂枝有抑制大鼠胸主動脈內膜增厚作用（P＜0.05），桂枝、水蛭、地龍降低血清TG 值作用較黃芪弱（P＜0.05），而大血藤無此作用（P ＞0.05）。

3 討論

研究證實[9]脂質代謝障礙是AS病變的基礎，TC、TG 代謝紊亂與臨床密切相關。TC 升高能聚集在血管壁逐步形成膽固醇結晶，刺激炎癥因子生成誘發血管炎性反應，使血管內皮功能紊亂，促使AS發生[10]。許多研究[11]表明LDL 和HDL 的結構改變可能是TG升高致動脈粥樣硬化作用的主要原因。LDL-C 增高是AS發生、發展的主要危險因素[12-13]，LDL在破損的血管內皮下被氧化形成氧化型LDL（Ox-LDL），經巨噬細胞吞噬后形成大量泡沫細胞，泡沫細胞聚集、融合構成動脈粥樣硬化斑塊的脂質核心，促進AS發生發展。研究表明[14]慢性炎癥反應貫穿整個AS病理過程，而LDL是慢性炎癥反應啟動和維持的基本要素。HDL能將外周血管壁內的膽固醇轉運至肝臟分解代謝，即膽固醇的逆轉運，因此減少膽固醇沉積于血管壁，抑制脂質斑塊形成，從而起到抗AS的作用[15]。已有大量證據表明提高血漿HDL，降低血漿TC、LDL-C可逆轉AS 的發生[16]。故改善脂質代謝紊亂是防治動脈粥樣硬化的重要措施。

血管內皮損傷是AS發生的始動環節，正常的動脈壁由腔面至外依次分為內膜、中膜和外膜三層。AS主要病理基礎是血管內膜增厚，其特征性表現為局部的粥樣斑塊性增生。通過內膜厚度的比較在一定程度上反映各組大鼠胸主動脈動脈粥硬化程度的不同。

蛭龍活血通淤膠囊目前廣泛應用于臨床AS 的治療。現代藥理研究證實黃芪能明顯清除氧自由基、改善微循環、抑制血小板黏附聚集，減少血栓形成，調節血脂，減少AS 的發生[17]；地龍具有抑制血小板聚集、促進血液流動、防止血栓形成和降血脂作用[18]；水蛭有降血脂和改善血液流變學作用[19]；桂枝也有抗血小板聚集、促進血液循環及明顯的降血脂作用[20]；大血藤有抗炎、抗自由基、抑制血小板聚集等作用[21]。本研究結果顯示，除拆6 號及7 號組外，與模型組相比余各藥物組均能降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C含量，能不同程度的影響大鼠胸主動脈形態學改變，保護血管內皮損傷，其中以蛭龍活血通瘀膠囊全方組和阿托伐他汀組效果最佳，這說明蛭龍活血通瘀膠囊能通過改善脂質代謝紊亂和保護大鼠胸主動脈形態學改變而影響AS的發生發展。且在不考慮藥物相互作用的情況下，黃芪、桂枝、水蛭、地龍在蛭龍活血通瘀膠囊抗AS效應中發揮主要作用，而大血藤在其中作用不明顯。

4 結論

蛭龍活血通瘀膠囊全方及有效拆方組對大鼠胸主動脈形態都有不同程度保護作用，能降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，改善脂質代謝，從而表現出抗AS效應。其中黃芪、地龍、桂枝、水蛭起主要抗AS作用，黃芪是核心藥味，若不考慮藥物間相互作用影響，大血藤可能無抗AS作用。