過表達ABAD對Aβ1-42刺激的293T細胞線粒體功能和自噬水平的影響

洪婷婷，張宇，崔理立

廣東醫科大學 廣東省衰老相關心腦疾病重點實驗室，廣東湛江 524001

淀粉樣蛋白結合醇脫氫酶(ABAD)也稱17β-HSD10，是一種線粒體蛋白質。已知ABAD有一個LD區域，可特異性與β-淀粉樣蛋白(Aβ)結合，Aβ與ABAD形成的復合物導致ABAD結構異常，進而阻止ABAD與NAD+的結合，ABAD不能發揮酶活性，線粒體膜通透性發生變化，進而導致線粒體窘迫和細胞毒性。此外，ABAD可調節線粒體基質中的親環蛋白D(cypD)，后者可調節線粒體通透性過渡孔的開放。同時，已知人線粒體RNase P是由三種蛋白質(ΜRPP1(線粒體核糖核酸酶P蛋白1)，ΜRPP2(17β-HSD10)和ΜRPP3(Μg2+依賴性核糖核酸內切酶))組成，ABAD是ΜRPP1蛋白穩定表達所必需的，ABAD的突變會引起RNaseP組分活性降低和RNA加工缺陷，導致線粒體功能紊亂[1-3]。

Aβ肽是由α、β和γ-分泌酶水解酶切淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)所產生的。正常情況下，絕大部分產生的是Aβ40，少量是Aβ42，但后者具有更強的疏水性、聚集性以及神經毒性。Aβ1-42可隨年齡依賴性快速生成并積聚，引起神經毒性。研究發現Aβ可聚集在線粒體內，降低呼吸鏈復合物酶的活性，減少線粒體的耗氧量，增加活性氧的產生，最終導致線粒體腫脹及后續的細胞凋亡[4-5]。線粒體作為機體細胞代謝的能量工廠，通過不斷的分裂和融合以為適應生命活動的需要，受損或多余線粒體的清除是維護細胞內環境的關鍵，線粒體自噬作為選擇性自噬的一種類型，是機體清除受損線粒體的重要形式之一[6]。理論上，線粒體功能絮亂，包括膜電位下降、活性氧生成增多、ATP產量減少等，會誘導機體啟動線粒體自噬，受損線粒體通過與溶酶體結合，清除受損的線粒體。但目前尚未有ABAD與線粒體自噬的相關報告。本文旨在研究在Aβ1-42刺激下過表達ABAD對293T細胞線粒體功能的影響，并探究其是否影響自噬相關蛋白的水平。

1 材料與方法

1.1 材料 293T細胞(上海中喬新舟生物公司)，血清、胰酶、雙抗(美國Gibco公司)，DΜEΜ高糖培養基(美國Gibco公司)，Lipo Fiter(漢恒生物科技有限公司)、BCA蛋白檢測盒(美國Thermo公司)，ABAD過表達質粒、ABAD干擾質粒(上海毅樂生物)，增強型ATP(三磷酸腺苷)檢測試劑盒、ROS(活性氧)檢測試劑盒(碧云天生物技術)，氧化磷酸化解偶聯劑CCCP(羰基氰化物間氯苯腙)(ΜCE)，Aβ1-42(β淀粉樣蛋白1-42)(上海強耀生物科技有限公司)，DΜSO(二甲基亞砜)(青島生物科技)，抗體：LC3B(Sigma)，P62、ABAD(Abcam)，β-actin(CST)，低溫高速速離心機(德國Eppendorf公司)，酶標儀、化學發光儀(美國Thermo公司)，曝光機(美國Azure Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 293T細胞購買于上海中喬新舟生物公司，使用完全培養基(10%胎牛血清+1%的雙抗+高糖培養基)在37℃、5%CO2細胞培養箱傳代培養。倒置顯微鏡下觀察細胞，每隔2～3 d傳代1次，用含EDTA胰酶消化3 min，加兩倍體積培養基終止胰酶消化。傳代3次后進行實驗。分組方法：(1)Control組、過表達ABAD組、Control給藥組(Aβ1-425μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)、過表達ABAD給藥組(Aβ1-425μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)；(2)Control組、sh-ABAD組；(3)Control+DΜSO組、Control+CCCP組、過表達ABAD+DΜSO組、過表達ABAD+CCCP組(WT/Aβ10μmol/L)。

1.2.2 細胞轉染 嚴格按照漢恒Lipo Fiter說明書轉染。細胞傳代3次后，按1×105/孔接種，細胞培養箱中培養24 h，細胞密度在60%左右進行轉染。ABAD過表達和sh-ABAD轉染終濃度為2μg/孔。轉染5～6 h后更換新的培養基繼續培養。24 h后，用配制的不同濃度Aβ1-42刺激細胞24 h。

1.2.3 Aβ1-42的配制 Aβ1-42母液配制：取人源Aβ1-42單體，用HFIP重懸，在通風櫥中揮發后獲得Aβ肽膜，以DΜSO溶解肽膜，稀釋至適當濃度后，37℃孵育48 h后即得到Aβ寡聚體，孵育后的溶液1周內使用。

1.2.4 氧化磷酸化解偶聯劑CCCP的配制 CCCP母液配制：離心試管，在無菌操作臺中稱取適量CCCP粉末，加入DΜSO，使濃度為20 mmol/L，充分震蕩混勻離心，即得到CCCP母液，1個月內使用。

1.2.5 ATP(三磷酸腺苷)檢測 按照產品說明書操作，吸除培養液，100μL裂解液/12孔板每孔，移液器反復吹打,充分裂解細胞。裂解后4℃12 000 g離心5 min，吸取的上清即為樣品。按照每個樣品/標準品需100μL ATP檢測工作液的比例配制適當量的ATP檢測工作液。把待用試劑在冰浴上融解。取適量的ATP檢測試劑，用ATP檢測試劑稀釋液稀釋ATP檢測試劑(1：4)。稀釋后的ATP檢測試劑即為ATP檢測工作液。加100μLATP檢測工作液到檢測管內，室溫放置5 min。檢測管內加上20μL樣品/標準品，迅速用槍混勻，間隔2 s后用化學發光儀測定RLU值。

1.2.6 活性氧(ROS)檢測 按照產品說明書操作，用無血清培養液稀釋2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽DCFH-DA(1∶1 000)，使終濃度為10μmol/L。用稀釋好的DCFH-DA重懸細胞，細胞濃度控制在100萬～2 000萬/mL，37℃細胞培養箱中孵育20 min。隔5 min上下顛倒混勻，待探針和細胞充分接觸后，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用流式細胞儀檢測熒光的強弱。

1.2.7 Western Blot 移除培養液，用冰PBS小心洗一遍，按100μL裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液，置于搖床冰上，裂解15 min，用細胞刮充分刮數下，收集蛋白至EP管。檢測細胞濃度(BCA蛋白檢測法)。各組樣本取相同摩爾質量和體積的蛋白量進行SDS-PAGE電泳(初始電壓為60 V，待蛋白條帶入分離膠，調整電壓至100 V)，預先將PDVF膜泡在甲醇液中5～10 min，待電泳結束，將其轉印至PVDF膜，趕走膜和膠之間的氣泡，放入轉膜槽(200 mA，100 min)，1x TBST稀釋的5%脫脂牛奶，搖床上常溫封閉1 h。將一抗和膜置于孵育袋中共同孵育(一抗稀釋液配制所有的一抗，濃度為1∶1 000)，4℃搖床過夜。回收一抗，1×TBST洗膜3次，10 min/次。二抗用1×TBST稀釋的5%脫脂牛奶溶解，與膜在搖床上常溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。顯色及曝光。采用Image J對Western blot條帶進行量化，將歸一化后目標蛋白灰度值與內參β-actin灰度值之間比值視為目標蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 所有實驗重復至少3次。應用IBΜSPSSStatistics 26對實驗結果進行統計分析。計量數據均經過正態性檢驗，符合正態分布，以均值±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 293T細胞過表達ABAD對線粒體功能的影響 為確定在293T細胞中過表達ABAD對線粒體功能的影響，分別測試其ATP、活性氧的變化。如表1所示，過表達ABAD組與Control組相比，ATP的產量和活性氧的生成變化不明顯，差異均無統計學意義(P＞0.05)。以上結果表明：ABAD過表達不影響293T細胞線粒體功能。為進一步證實ABAD作為線粒體蛋白在線粒體功能起重要作用，分別測試干擾ABAD后293T細胞的ATP和活性氧的變化。如表2所示，干擾ABAD使293T細胞ATP產生減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)，但不影響活性氧的生成，差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 293T細胞過表達ABAD線粒體功能比較(±s，n=4)

表1 293T細胞過表達ABAD線粒體功能比較(±s，n=4)

組別Control組ABAD組t值P值ATP 0.983 3±0.047 13 1.021±0.077 44 0.419＞0.05 ROS 0.668 2±0.068 20 0.739 7±0.029 66 0.961＞0.05

組別Control組ABAD組t值P值ATP 13.46±0.333 9 8.274±1.431 0 3.529＜0.05 ROS 0.862 9±0.052 8 0.821 7±0.023 1 0.712 7＞0.05

2.2 不同Aβ濃度刺激下293T細胞過表達ABAD對線粒體功能的影響 為了進一步驗證Aβ刺激下，過表達ABAD對線粒體功能的影響，在293T細胞過表達ABAD后加入5μmol/LAβ1-42，分別測試其ATP和活性氧。如表3所示，無論有無Aβ1-42刺激，過表達ABAD的293T細胞ATP產量和ROS產生變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，這可能是Aβ濃度還不足以與ABAD結合，引起其構象改變，因此增添了兩個濃度的Aβ1-42，即10μmol/L和20μmol/L。如表3所示，只有在Aβ1-42刺激濃度在10μmol/L時，過表達ABAD組與Control組相比，ATP產量相對減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)。這可能是ABAD與Aβ1-42的結合需要一定的濃度范圍，濃度范圍過低不能競爭結合ABAD，濃度過高，Aβ1-42本身的毒性作用已經足以損害細胞產能。

表3 不同Aβ濃度下各組的線粒體功能比較(±s，n=4)

表3 不同Aβ濃度下各組的線粒體功能比較(±s，n=4)

組別Control組ABAD組t值P值Control+Aβ(5μmol/L)組ABAD+Aβ(5μmol/L)組t值P值Control+Aβ(10μmol/L)組ABAD+Aβ(10μmol/L)組t值P值Control+Aβ(20μmol/L)組ABAD+Aβ(20μmol/L)組t值P值ATP 1.028±0.0456 3 1.072±0.007 340 0.950 7＞0.05 0.855 9±0.037 65 0.891 8±0.034 90 0.699 8＞0.05 0.931 0±0.047 47 0.660 7±0.086 39 2.000 0＜0.05 0.860 3±0.015 10 0.802 6±0.090 60 0.628 5＞0.05 ROS 0.903 2±0.041 02 0.834 6±0.048 14 1.085＞0.05 0.834 6±0.034 86 0.865 6±0.023 09 0.741 7＞0.05 0.7729±0.056 07 0.8437±0.129 0 0.503 4＞0.05 0.896 9±0.014 95 0.879 9±0.054 56 0.299 6＞0.05

2.3 293T細胞過表達ABAD對線粒體自噬蛋白水平的影響 過表達ABAD對線粒體功能無明顯影響，且只在Aβ1-42特定濃度下線粒體ATP產生減少。為進一步探究過表達ABAD與線粒體自噬的關系，在293T細胞中過表達ABAD 24 h，再用線粒體自噬誘導劑CCCP 20μmol/L處理6 h，觀察線粒體自噬相關蛋白P62和LC3B的蛋白水平。如圖1、表4所示，在293T細胞中過表達ABAD，P62蛋白水平下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)，但LC3B蛋白水平變化不明顯，差異無統計學意義，提示正常ABAD過表達可能影響溶酶體，因為P62是溶酶體的標志蛋白。

表4 293T細胞過表達ABAD線粒體自噬相關蛋白P62和LC3B比較(±s，n=6)

表4 293T細胞過表達ABAD線粒體自噬相關蛋白P62和LC3B比較(±s，n=6)

組別Control+DΜSO組ABAD+DΜSO組t值P值Control+CCCP組ABAD+CCCP組t值P值ABAD蛋白1.284±0.141 1 4.795±0.439 8 7.602＜0.05 1.070±0.1683 4.129±0.3662 7.592＜0.05 P62 1.405±0.156 1 1.028±0.044 59 2.322＜0.05 1.289±0.145 2 0.8007±0.068 20 3.042＜0.05 LC3B 1.872±0.261 6 1.812±0.045 39 0.225 1＞0.05 2.550±0.250 0 2.768±0.194 3 0.687 9＞0.05

圖1 在CCCP自噬誘導劑誘導下，293T細胞過表達ABAD不引起線粒體自噬發生

2.4 Aβ1-42刺激下293T細胞過表達ABAD對線粒體自噬蛋白水平的影響 只在Aβ1-4210μmol/L誘導下，過表達ABAD可使線粒體ATP的產生減少，因此考慮ATP產生受損是否會誘發線粒體自噬，故在293T細胞中過表達ABAD，加入Aβ1-4210μmol/L 24 h，再加入CCCP誘導劑20μmol/L 6 h，觀察線粒體自噬蛋白水平的變化，如圖2、表5所示，在Aβ1-42刺激下，CCCP誘導自噬過程中293T細胞過表達ABAD使P62蛋白水平降低、LC3B水平升高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，提示過表達ABAD在Aβ1-42刺激下促進線粒體自噬發生。

圖2 在Aβ1-42 10μmol/L刺激下，293T細胞過表達ABAD促進線粒體自噬發生

表5 Aβ1-42 10μmol/L刺激下，293T細胞過表達ABAD線粒體自噬相關蛋白P62和LC3B比較(±s，n=6)

表5 Aβ1-42 10μmol/L刺激下，293T細胞過表達ABAD線粒體自噬相關蛋白P62和LC3B比較(±s，n=6)

組別Control+DΜSO組ABAD+DΜSO組t值P值Control+CCCP組ABAD+CCCP組t值P值ABAD蛋白2.618±1.171 33.61±0.994 9 20.17＜0.05 1.524±0.380 8 41.52±1.676 23.27＜0.05 P62 0.698 4±0.043 08 0.576 4±0.034 29 2.216＞0.05 0.762 1±0.052 15 0.618 4±0.021 06 2.554＜0.05 LC3B 0.499 0±0.050 32 0.240 7±0.013 33 4.962＜0.05 0.758 3±0.033 44 0.928 9±0.032 41 3.663＜0.05

3 討論

ABAD屬于羥基甾體脫氫酶家族，在成年人和胎兒大腦海馬及杏仁核的神經元中表達最為豐富[7]。在小鼠和爪蟾胚胎的研究發現，胚胎早期喪失ABAD可能是致命的，因為在敲除ABAD基因后小鼠胚胎早期出現了因線粒體功能障礙導致的細胞凋亡和死亡，這意味ABAD在細胞存活中起著重要作用，且研究還發現這種作用獨立于其酶的催化活性，可能是其存在為機體提供了某些結構功能，又或者參與維持結構的完整性。另外，研究發現ABAD的LD區域可特異性與Aβ結合，導致ABAD結構異常，不能發揮酶活性，線粒體膜通透性改變，導致線粒體窘迫和細胞毒性。同時，有報道表明，使用ABAD誘騙肽(ABAD-DP)來拮抗Aβ和ABAD的結合能保護神經元線粒體功能，而ABAD與Aβ分離，則能使線粒體、神經元免受Aβ的毒性[8-12]。由上可知，ABAD作為一種線粒體蛋白，在維持線粒體穩態中起著至關重要的作用，而ABAD又能與Aβ相互作用，影響線粒體正常功能發揮。當線粒體功能受損超過一定閾值時，機體則會啟動線粒體自噬途徑，清除受損線粒體，調節線粒體穩態。

線粒體自噬是各種內外刺激誘發、由自噬囊泡包裹、吞噬受損的線粒體，通過與溶酶體相結合，降解其包裹的內容物的過程。當線粒體遭受輕微刺激時，機體首先啟動線粒體融合作用，通過與健康線粒體融合以中和受損線粒體的傷害，但當線粒體損傷超出線粒體融合所承受的范圍，則機體將促線粒體進行分裂，把受損部分的線粒體分離，通過線粒體自噬途徑清除[13]，其中LC3B和P62是檢測自噬通量的兩個主要標志物。自噬發生時，新生成的LC3則從胞漿型LC3轉變為膜型LC3；P62作為特異性底物，與LC3相互作用，在自噬-溶酶體通路中被降解，通過測量LC3比值和P62水平可評估自噬水平的高低。

目前為止，僅有部分研究探究過表達ABAD與Aβ相互作用對線粒體功能的影響，但少有涉及其線粒體自噬通路機制，本實驗旨在為對其進行補充，先在最基本的293T細胞器探究在Aβ存在下，過表達ABAD對線粒體功能的影響及其與線粒體自噬的關系，為后續進一步的實驗奠定基礎。研究結果表明，在293T細胞中，過表達ABAD并不會影響線粒體功能，而干擾ABAD則只能影響線粒體ATP的生成。僅在10μΜ濃度Aβ1-42刺激下影響線粒體ATP的生成，并促線粒體自噬發生。對所得的研究結果歸納幾個猜想：(1)神經元是高需能場所，更易受Aβ聚集的破壞。Aβ1-42對293T細胞產生的毒性作用亞于神經元細胞；(2)ABAD作為線粒體成分，但其含量較小，其與Aβ的結合僅些微改變線粒體功能；(3)考慮到線粒體功能受損影響功能可能存在次序，而非同步出現，輕微的損傷只影響ATP的生成，而活性氧產生可能是后期受損嚴重的結果；(4)線粒體嚴重受損才能誘發線粒體自噬，CCCP誘導劑本身也是具備毒性作用，加上ABAD與Aβ的相互作用產生的毒性作用，才足以破壞線粒體，促使線粒體自噬發生。

綜上所述，ABAD作為線粒體成分的重要一員，其過表達并不影響293T細胞的線粒體功能，但在特定濃度Aβ1-42刺激下發生相互作用，減少線粒體ATP生成，促進線粒體自噬發生。本次研究尚有很多不足之處，如線粒體功能及線粒體自噬檢測方式多樣，細胞器的選擇及補充等，相關的實驗還需進一步探究以明確ABAD與Aβ的結合影響線粒體功能及自噬這一機制。