煙草廢棄物中煙堿生物調控的研究進展*

張豪洋 黨炳俊 金伊楠 李子瑋 孫燕鑫 郭笑恒 許自成

(河南農業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州 450002)

我國是煙草種植大國，植煙面積超過100萬hm2，年均產生的煙草廢棄物多達400萬t[1]。煙草廢棄物中含有大量有害物質，如煙堿、氨基聯(lián)苯等，隨意排放會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成嚴重危害。美國環(huán)境保護署(EPA)早在1994年就在環(huán)境限制釋放目錄清單中加入煙堿，歐盟也有相關法律規(guī)定，當煙草廢棄物中煙堿質量分數(shù)高于0.05%時，即被歸類為有害危險廢棄物，需謹慎處理。然而，煙草廢棄物中含有茄尼醇等重要化合物[2]155，其獨特的物質組成及物理特性使其具有較高的應用價值。

由于人們對煙草的清潔生產和煙草廢棄物的資源化利用意識相對較弱，導致大量的煙草廢棄物不能得到及時有效處理。煙草廢棄物的資源化、經濟化利用已成為煙草行業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。目前，煙草廢棄物的資源化途徑主要有3種：(1)提取煙草廢棄物中的重要化合物；(2)將煙草廢棄物制成功能型材料[3]；(3)將煙草廢棄物堆肥制成有機肥。煙草廢棄物資源化利用前，先要妥善處理其中的煙堿。煙堿又名尼古丁，是由吡啶環(huán)與吡咯環(huán)組成的結構穩(wěn)定的有毒雜環(huán)化合物，廣泛存在于多種茄科(Solanaceae)植物中，是煙草中含量最多的一種生物堿[4]，其對環(huán)境可造成一定危害。微生物降解煙堿具有降解能力強、功能微生物種類豐富、降解途徑多樣、對環(huán)境影響小等特性，是一種低成本、高效率的煙堿處理方法。因此，通過微生物材料以及生物調控技術對煙草廢棄物進行處理，在提高煙草資源利用率、增強土壤肥力和保護生態(tài)環(huán)境等方面具有重要意義。因此，本研究對煙草廢棄物中煙堿生物調控技術進行了綜述，以期為處理煙草廢棄物、降低煙堿含量以及緩解環(huán)境污染等研究提供參考。

1 煙堿的危害及污染來源

1.1 煙堿的危害

煙堿是一種有毒的雜環(huán)化合物，純煙堿在室溫下為無色或淡黃色的油狀液體，在低于60 ℃時可與水以任意比例混合，也可溶于醇類、醚類和氯仿等有機溶劑[5]。煙堿在自然條件下不易被降解，且易溶于水，容易通過淋溶作用進入土壤和地下水，造成土壤和水污染，破壞生態(tài)平衡。煙堿進入人體后會與中樞神經系統(tǒng)的煙堿型乙酰膽堿受體相結合，進而對人體的多種組織和細胞造成損害[6]。煙堿還會增加血漿的濃度，導致心血管等諸多部位疾病發(fā)病率的升高[7]。

1.2 煙堿的污染來源

造成環(huán)境污染的煙堿主要來源于煙草廢棄物，煙草中煙堿含量可占煙草生物堿總量的95%[8]，煙草廢棄物中的煙堿質量分數(shù)高達0.5%～8.0%。除此之外，煙堿污染的另一大源頭是新煙堿型農藥。近年來，新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、噻蟲嗪和啶蟲脒憑借其高效、廣譜等特點，已成為我國農業(yè)生產中使用的第四大類農藥，廣泛應用于果蔬的病蟲害防治中[9]。隨著新煙堿型農藥的廣泛使用，其對人類健康的影響和對生態(tài)環(huán)境的污染已成為科技工作者們必須面對和研究的問題，經過多年的研究發(fā)現(xiàn)，兩種來源的煙堿都可通過具有煙堿降解能力的微生物進行控制和解決。

2 煙堿生物調控技術

2.1 可降解煙堿的微生物種類

現(xiàn)階段的煙堿調控技術大多通過農藝措施和生長調節(jié)劑來調控煙草體內煙堿的合成，如打頂、抹杈、減少氮肥施用量和葉片噴施藥劑等[10]。除此之外，常規(guī)的物理化學方法也可以降解煙堿，但這些方法不僅耗費時間且價格高昂。目前，針對煙堿的生物調控領域研究主要集中在微生物降解上，微生物作為自然界中廣泛存在的微小生物體，是物質循環(huán)必不可少的推動者，其在調控煙草廢棄物中的煙堿含量上發(fā)揮著積極的作用且具有重要應用前景。迄今為止，已經報道的可降解煙堿的微生物主要為細菌，真菌相對較少?？山到鉄焿A的細菌中50%以上屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)[11]和假單胞菌屬(Pseudomonas)[12]，其他菌株大多為產堿菌(Alcaligenes)、無色桿菌屬(Achromobacter)[13-14]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[15]和中間蒼白桿菌屬(Ochrobactrumintermediate)等[16]。煙堿降解菌大多為好氧微生物，主要通過礦化方式對煙堿進行降解，且這些菌株具有較強的耐煙堿性，可將煙堿轉化為羧酸和氨基酸，從而起到降解有毒有害廢棄物的作用。目前國內外大批研究人員從煙葉、土壤和卷煙廠廢棄物中分離得到的多種煙堿降解菌及其最佳降解條件匯總于表1。

表1 具有煙堿降解能力的菌株

2.2 微生物降解煙堿的代謝途徑

微生物降解煙堿的途徑主要有吡啶途徑、吡咯烷途徑、脫甲基以及吡啶和吡咯烷交叉途徑等[42-44]。

2.2.1 吡啶途徑

節(jié)桿菌屬微生物主要通過吡啶途徑降解煙堿。在吡啶途徑中，菌株先將煙堿吡啶環(huán)羥基化形成6-羥基煙堿，然后再將吡咯環(huán)氧化形成6-羥基-N-甲基麥斯明，并自發(fā)水解生成6-羥基假氧化煙堿[45]。隨后通過羥基化反應生成2，6-二羥基假氧化煙堿，繼而重復自發(fā)水解過程生成γ-N-甲基氨基丁酸和3,6-二羥基吡啶，其中γ-N-甲基氨基丁酸可生成γ-氨基丁酸，3,6-二羥基吡啶繼續(xù)反應生成2,3,6-三羥基吡啶和馬來酸[46]。煙堿吡啶途徑的代謝通路見圖1。

圖1 吡啶途徑Fig.1 Pyridine pathway

2.2.2 吡咯烷途徑

吡咯烷途徑始于吡咯烷環(huán)中碳氮鍵的氧化，是假單胞菌屬的主要代謝途徑。在該途徑中煙堿首先脫氫生成6-羥基-N-甲基麥斯明，自發(fā)水解生成假氧化煙堿，實現(xiàn)吡咯環(huán)的打開，而后吡咯環(huán)脫甲胺生成3-琥珀酰吡啶，隨后通過羥基化反應生成6-羥基-3-琥珀酰吡啶，最后生成2，5-二羥基吡啶和琥珀酸鹽，逐步完成煙堿的分解[21]1495。煙堿吡啶烷途徑的代謝通路見圖2。

圖2 吡咯烷途徑Fig.2 Pyrrole pathway

2.2.3 脫甲基途徑

脫甲基途徑的第1步是吡咯環(huán)進行脫甲基化反應，其代謝產物也是2，5-二羥基吡啶和琥珀酸。但與該途徑各步反應中的酶類和相關的基因描述很少，具體代謝通路還有待進一步研究[21]1496。

2.2.4 吡啶和吡咯烷交叉途徑

WANG等[29]研究證實在AgrobacteriumS33中存在吡啶和吡咯烷交叉途徑。并從該途徑中檢測出5種中間產物，其中6-羥基煙堿、6-羥基-N-甲基麥斯明和6-羥基假氧化煙堿與吡啶途徑的中間產物一致，6-羥基-3-琥珀酰吡啶和2,5-二羥基吡啶與吡咯烷途徑的中間產物相同。

2.2.5 其他途徑

近年來，隨著科研工作者對微生物降解煙堿代謝途徑和降解機理的研究不斷深入，新的煙堿代謝產物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。孫柯丹[31]在研究菌株Pseudomonassp. ZUTSKD對煙堿的降解產物時發(fā)現(xiàn)了2,3-二吡啶、3-(2,3,4-三氫-5-吡咯基)-吡啶和可替寧等物質，推測菌株Pseudomonassp. ZUTSKD降解煙堿的第1步可能是通過可替寧脫甲基反應后生成3-(2,3,4-三氫-5-吡咯基)-吡啶。因此，菌株Pseudomonassp. ZUTSKD對煙堿可能有新的降解途徑。另有學者通過分析菌株Pseudomonassp.HF-1降解煙堿的中間產物時發(fā)現(xiàn)了麥思明等物質[23]。RAMAN等[38]通過高效液相色譜(HPLC)和氣質聯(lián)用色譜(GC/MS)等對菌株PseudomonasplecoglossicidaTND35降解煙堿的過程進行研究，并檢測出3種新的未知中間產物。煙堿降解菌中仍存在許多未知的代謝途徑有待進一步探索，后期可從已知酶入手進行機制研究，也可對一些涉及的酶進行鑒定，或通過生物工程的手段對已知途徑進行改造以生產出更加有用的合成中間體。

2.3 煙堿生物調控的研究動態(tài)

早在20世紀中葉國外就已經開展了煙堿降解的相關研究。1954年WADA等[2]156從土壤中分離出細菌A和細菌B，它們可利用煙堿作為氮和碳的唯一來源進行生長代謝，并觀察到在細菌A和細菌B存在時煙草生物堿和相關化合物可被吸收。HONG等[33]從煙草種植土壤中分離出細菌菌株ND12，該菌株可利用煙堿作為唯一的碳和氮源，在28 ℃、pH=6.0的條件下14 h內完全降解1.0 g/L煙堿，ND12菌株生長的最佳煙堿質量濃度為2.5 g/L。WANG等[41]研究發(fā)現(xiàn)，SphingomonasmelonisTY菌株可利用煙堿作為唯一的碳、氮源生長，且該菌株通過NdpT這類煙堿轉運相關蛋白來完成煙堿的降解。SHANG等[47]研究菌株Phanerochaetechrysosporium、Bacillusthuringiensis時發(fā)現(xiàn)它們可通過調節(jié)土壤氮含量進而降低煙葉中的煙堿含量并改善煙草質量。WANG等[48]將具有高效煙堿降解能力的Pseudomonassp. HF-1添加到被煙草廢棄物污染的土壤中，與對照組相比，添加HF-1菌株的土壤表現(xiàn)出更強的污染處理能力、更高的pH和穩(wěn)定的水分含量，且HF-1菌株可在土壤中持續(xù)存在，從而大大提高了煙草廢棄物的處理效率。ZHU等[49]對Sphingomonassp. NIC1菌株的完整基因組序列進行分析，證實其可有效降解煙堿。GONG等[50]研究發(fā)現(xiàn)Rhodococcussp. Y22擴增可得到煙堿脫氫酶ndh的編碼基因，并且在煙堿誘導下，該菌株的轉錄水平明顯上調，具有較強的煙堿降解能力，可從煙草廢棄物中降解煙堿以達到環(huán)境要求。MIHASAN等[51]利用微生物蛋白質組學對PaenarthrobacternicotinovoranspAO1中的煙堿代謝途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)其降解途徑是由包含約40個與煙堿相關的基因組成的分解代謝質粒pAO1編碼操控，該細菌能夠利用煙堿作為碳源，在較低煙堿含量下進行脫氨和脫甲基之間的切換，從而實現(xiàn)對煙堿的降解。LI等[52]從海洋沉積物中分離出具有煙堿降解能力的細菌JQ581，根據(jù)形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA基因分析將其鑒定為假單胞菌屬成員，且煙堿降解中間體為假氧化煙堿和3-琥珀酰吡啶，并通過基因組序列分析發(fā)現(xiàn)該菌株含有煙堿降解的基因簇。LI等[53]從富含煙堿的環(huán)境中分離出可降解和耐受高含量煙堿的Pseudomonassp. JY-Q菌株，發(fā)現(xiàn)nicA2和nox基因都參與了煙堿的降解，此外hpo1和hpo2基因在降解過程中也發(fā)揮著重要作用。MARIUS等[54]通過蛋白組學方法對細菌Paenarthrobacternicotinovorans中的質粒pAO1進行分析，使用納米液相色譜/質譜聯(lián)用系統(tǒng)(nanoLC-MS/MS)鑒定出聚在511個非冗余蛋白簇中的801個蛋白質，蛋白質豐度的差異表明，當檸檬酸鹽存在時，脫氨效果較好。

國內關于煙草廢棄物中煙堿生物調控的研究起步較晚。袁勇軍等[55]發(fā)現(xiàn)了一種能降解煙堿的細菌并命名為DN2，經過鑒定該菌屬于中間蒼白桿菌屬，其對煙堿的最佳降解條件為30 ℃、pH 6.5。韓娜娜[56]從煙草廢棄物污染的土壤中篩選出一株煙堿降解細菌并將其命名為中間蒼白桿菌E3，其在pH 7.0、35 ℃、酵母膏添加量1.0 g/L的條件下對煙草加工廢水中的煙堿降解率可達100%。龍章德等[57]從植煙土壤中篩選出一株可耐受8 g/L煙堿的菌株，并將其命名為Microbacteriumsp. GYC29，其煙堿降解率可達82%。李天麗等[58]從醇化煙葉中分離得到具有降解煙堿活性的菌群(Q6)，并在該菌群的煙堿代謝產物中檢測到煙堿烯、2,3’-聯(lián)吡啶和可替寧的存在，這些物質與煙葉品質關聯(lián)密切，因此可以通過微生物降解醇化煙葉中的煙堿從而達到改善煙葉品質的目的。洪駿[59]利用具有煙堿降解能力的菌株Shinellasp. HZN7對被煙草廢棄物污染的土壤進行修護，發(fā)現(xiàn)菌液添加量為100 g/kg時對土壤的修復效果最好，可有效去除土壤中的煙堿殘留，對保護土壤生態(tài)環(huán)境起到了積極作用。劉彩紅[60]從一個新的角度對煙草廢棄物進行處理，通過淀粉酶酶解作用將煙草廢棄物中的有害物質降解為可再利用的葡萄糖等小分子化合物，再經過加工合成酶解濃縮液，酶解濃縮液可與L-丙氨酸發(fā)生美拉德反應，進一步提升卷煙香氣，實現(xiàn)煙草廢棄物的資源化利用。汪美貞[61]通過質粒消除轉化和關鍵基因hsp的聚合酶鏈反應(PCR)及反轉錄聚合酶鏈擴增(RT-PCR)等方法證明了質粒pMH1是不同于pAO1的新型煙堿降解質粒，該質?？赡芎泻蜔焿A降解相關的hsp和amo基因。目前已有研究證實生物調控技術對煙草廢棄物中的煙堿降解具有積極作用，且已發(fā)現(xiàn)降解率較高的菌屬以及新的研究方向。

目前我國煙草廢棄物資源化利用效率不高，主要原因是其中的煙堿無法得到快速有效處理。微生物種類和降解機制的多樣性為卷煙的制造加工和煙草廢棄物污染的處理提供了更加豐富的資源和更加多樣化的選擇，但因微生物降解煙堿的機制較為復雜，對降解方式和降解機制的研究還不夠細化，因此目前這項技術還沒有高效地應用于實踐中，后續(xù)可以加深煙堿生物調控從基礎研究向應用研究的轉化。

2.4 生物調控技術的其他應用

在煙草生產過程中污水處理廠面臨大量含煙堿的廢水無法解決的問題，通過具有煙堿降解能力的微生物或生物催化劑進行調控，可以有效降低煙堿對人體和生態(tài)環(huán)境所造成的危害，對緩解煙草廢棄物造成的環(huán)境污染起到積極作用。我國多數(shù)卷煙廠儲存上部煙葉，但上部煙葉的煙堿含量偏高，通常不易在卷煙配方中使用，而利用微生物降解煙堿可改善煙葉的內在品質，提高煙葉資源的利用率。通過煙堿的生物調控技術處理煙葉不僅能夠減少煙葉在倉庫中的陳化發(fā)酵時間，降低包括煙堿、蛋白質和亞硝胺等有害物質的含量，還可在不破壞煙葉抽吸品質的同時提高質量，防止煙葉受潮變質。

3 展 望

降低煙草廢棄物中煙堿的含量，減少煙堿對環(huán)境的危害，是煙草廢棄物資源化處理的首要任務。微生物對煙堿的耐受性極高，可將煙堿作為碳、氮和能量的唯一來源，通過不同的代謝途徑將煙堿降解為低危害或可再利用的無害物質。

目前煙堿生物調控技術仍有許多問題有待解決，如生物調控技術多側重于微生物調控，其他調控技術還有待發(fā)現(xiàn)；微生物種類和降解途徑繁多，沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫進行歸類匯總；缺乏縱向的深入研究，調控機制尚不完全清晰等。在未來的研究中，可通過觀察卷煙生產過程中各時期微生物的變化，探尋合適的微生物制劑施用時間和施用方法，為微生物在煙草中的合理利用提供更加可靠的技術支持；對煙堿的生物調控代謝機制研究可通過酶學和分子生物學技術找到關鍵酶及其基因，并通過基因工程對相關基因進行克隆、編輯和修飾等，使生物調控煙堿的能力提高；隨著基因組學的不斷發(fā)展，可通過基因組學探索除微生物外更多關于煙堿降解的生物技術。綜上所述，煙草廢棄物中煙堿生物調控技術的開發(fā)與應用具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬埃軌驗闊煵萆a加工以及生態(tài)環(huán)境保護提供技術支持。