乳鐵蛋白生理活性及作用機理研究進展

張 雷，王文利，程智美，汪 雄，魏斯晗，王 潔，戴蘊平，張雅麗

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100000)

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是一種非血紅素球狀鐵結合糖蛋白，分子量大約為80 kDa[1]，1960年由科學家Montreuij和Johansonb首次從母乳中分離純化出來后，受到廣泛關注[2]。LF主要分布在哺乳動物乳汁和其他多種組織液中，如存在于粘膜分泌物中，包括眼淚、唾液、陰道分泌物[3]、精液、胃腸液、鼻腔分泌物、支氣管分泌物、子宮分泌物等，以及膽汁和尿液等[4]。在嗜中性粒細胞、巨噬細胞和腺上皮細胞中也發現了LF的表達和分泌[5]。人乳中LF濃度約為1.0～3.2 g/L，是牛乳中的10倍，占普通母乳總蛋白的20%，人初乳中LF濃度甚至高達6～14 g/L[6]。由于LF有多種生理功能，比如：調節免疫反應、調節腸道菌群、調節糖脂代謝、抗菌、抗癌，因此其具有強大的應用價值和市場開發潛力，被社會各界廣泛關注。

1 乳鐵蛋白的結構

LF是由單一多肽鏈組成的一種糖蛋白，人乳鐵蛋白(Human lactoferrin，hLF)和牛乳鐵蛋白(Bovine laetoferrin，bLF)分別由691和696個氨基酸[7]組成，且不同物種間具有高度同源性。它由一條多肽鏈折疊成兩個對稱葉(N葉和C葉)，兩個葉呈球狀并具有類似折疊，具有一定的同源性。LF表面帶正電，等電點為8.0～8.5。其N葉上存在LF最大正電荷區域，這一結構特征使得LF易于與陰離子結合。同時，其N末端有一殺菌區域，當該區域被水解釋放時，能夠形成破壞細胞膜的兩親性結構[8]。N葉與C葉之間通過一條α鉸鏈連接，使得LF分子具有靈活性[3]。LF每個葉片包含一個鐵結合位點，并與CO32-協同結合Fe2+或Fe3+以及Cu2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子[9]。由于LF能夠可逆地結合Fe3+，因此其具有三種不同的三級結構：飽和型(holo-LF，結合兩個Fe3+)、半飽和型(half-LF，結合一個Fe3+)、不飽和型(apo-LF，無Fe3+結合)[10]。apo-LF具有開放構象，具有更強的抗菌性，而holo-LF是一種封閉的分子，具有更強的蛋白水解抗性[11]。另外，LF糖基化的位點會影響LF對蛋白水解和熱變性的敏感性[12]，并且有研究報道稱許多病原體的發病機制依賴于與LF糖基的結合[13]。LF的N-聚糖主要是高甘露糖和N-乙酰葡糖胺[14]，在hLF中，大約5%的分子在一個位點被糖基化(Asn 479)，85%的分子在兩個位點被糖基化(Asn138和Asn479)，9%的分子在三個位點被糖基化(Asn138,Asn479和Asn624)[15]。而在bLF中，也已經報道了5個潛在的糖基化位點，大多數bLF分子在Asn 233、281、368、476處被糖基化，只有15%～30%的LF分子利用Asn281糖基化位點[16]。

2 乳鐵蛋白參與免疫系統

免疫系統可通過識別和響應多種免疫反應來保護機體免受潛在的有害環境刺激。LF因具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化等多種生物活性，在免疫系統中扮演著重要角色。

2.1 乳鐵蛋白的抗炎作用

LF主要通過作用于免疫細胞和免疫因子，發揮免疫調節作用。淋巴細胞、單核白細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)等免疫細胞上有LF的特定受體，LF通過與這些免疫細胞的特異性受體相互作用，進行免疫調節。如：LF與樹突狀細胞相互作用可誘導其成熟[17]；與巨噬細胞相互作用可使其被激活，增強其吞噬能力和促進白介素-12(Interleukin-12，IL-12)的合成，IL-12是一種細胞因子，能吸引更多的巨噬細胞進入發炎的區域，并激活T CD4+淋巴細胞[18]；與NK作用可增強細胞活性和增加細胞數量，促進血液中多形核細胞(polymorphonuclear cell，PMN)的聚集，并誘導NK發揮吞噬作用[19]。LF還可刺激B淋巴細胞的分化和成熟，增強T淋巴細胞的表達，并促使抗原呈遞細胞活化、成熟及向炎癥區域遷移[1]。

當機體出現炎癥反應時，LF還可調節細胞因子的表達來抑制機體炎癥反應[20]。Li 等[21]發現LF通過下調NF-κβ通路，同時激活腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的表達抑制脂多糖(Lipopolysaccharide ，LPS)誘導的小鼠子宮內膜炎；Aly等[22]發現用重組人乳鐵蛋白(Recombinant human lactoferrin，RhLF)及其水解物處理Caco-2細胞可保護該細胞單層完整性，并減少IL-8和活性氧物質的產生，以此減輕LPS誘導的炎癥；Kim等[23]也發現LF可降低LPS誘導的MC3T3-E1細胞中促炎細胞因子水平，同時減輕活性氧效應和炎癥反應。

2.2 乳鐵蛋白的抗菌作用

LF的抗菌機制大概分為以下四個方面：首先，早期大量的研究表明，多數微生物都需要鐵才能生長，如銅綠假單胞菌[24]、阪崎腸桿菌[25]、大腸桿菌O157:H7[26]、金黃色葡萄球菌[8]等需要鐵才能形成生物膜，而LF與鐵的結合能力是轉鐵蛋白的300倍[27]，因此LF通過對鐵的螯合作用能有效地抑制細菌生物膜的形成[28]。其次，LF N-末端帶正電荷的肽片段可與革蘭氏陰性菌外膜帶負電荷的LPS產生靜電相互作用，從而導致細菌外膜的結構紊亂，最終破壞細菌細胞膜通透性[29]。再次，當細菌感受到潛在的靶細胞后，會利用自身分泌的毒力蛋白復合物入侵細胞，而LF的N端具有絲氨酸蛋白酶功能，能夠降解這些蛋白質[30]，從而阻止細菌與宿主細胞的結合[31-32]。最后，LF能通過競爭性結合目標細胞表面的膜糖胺聚糖來降低細菌的結合能力，從而防止細菌粘附到目標細胞[33]。

2.3 乳鐵蛋白的抗病毒作用

近年來研究發現，LF對引起流感、病毒性胃腸炎、皰疹及人類免疫缺陷性疾病的病毒有一定抑制效果。在某些病毒的感染初期，如：丙型肝炎病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒(HSV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)，LF可通過直接附著病毒顆粒或阻斷其細胞受體來抑制病毒顆粒進入宿主細胞[34,3]。LF還可通過誘導抗病毒細胞因子干擾素-α/β(interferon -α/β，IFN-α/β)的分泌來抑制小鼠諾如病毒對細胞的附著和病毒在細胞內的復制[35]。此外，LF還可增強NK細胞和Th1淋巴細胞的活性以增強機體免疫力，Th1淋巴細胞可分泌IFN-γ、IL-12、IL-18等細胞因子來保護機體免受某些病毒的感染，如LF對H1N1、H3N2和H5N1等流感病毒活性的抑制[36-37]。

2.4 乳鐵蛋白的抑癌作用

國內外研究報道LF對最常見的五種癌癥包括肺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌都有一定的抑制作用[38]。LF的抑癌機制主要有以下幾個方面：a.LF可增加血液中NK細胞和T細胞數量并促進T、B細胞的成熟，進而增強機體的免疫力[39]。b.LF可阻止癌細胞周期由G1期向S期過渡，使癌細胞進入生長停滯期，同時激活癌細胞內FAS信號途徑，誘導癌細胞程序性死亡[40]。c.LF能抑制腫瘤新生血管生成。腫瘤新生血管的生成在腫瘤生長、轉移的過程中具有重要的作用，如果沒有新生的血管支持，腫瘤的生長就會停止。如：LF能抑制口腔癌細胞系CAL-27 細胞中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的轉錄和表達，進而抑制腫瘤組織血管生成，抑制口腔癌細胞增長和轉移[41]。d.LF可破壞癌細胞膜結構從而誘導癌細胞的凋亡[42]。

2.5 乳鐵蛋白與腸道健康

腸道作為一種人體重要的粘膜保護系統，其健康關乎身體各部分機能的正常運行。研究表明，LF可從改善腸道細胞、腸道炎癥、腸道菌群等方面維持腸道健康。如：新生兒壞死性結腸炎(Necrotizing colitis，NEC)是由細菌或其毒素在腸道中引發的過度炎癥反應，嚴重威脅新生兒健康。大量臨床研究發現，給新生兒喂食LF后，NEC發病率與腹瀉發病率遠低于對照組[43-44]。這是由于LF可通過促進腸道成熟和腸細胞的增殖，從而關閉腸壁間隙連接點，防止腸壁泄露，維持腸道健康[45]。LF對腸道健康的維持還體現在以下幾個方面，一方面，LF能促進小腸絨毛的發育，降低隱窩深度，從而提高小腸對營養物質的消化吸收能力，減少腹瀉發生；另一方面，LF能提高血清中免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)水平，降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6的水平，并促進Th1、Th2的分化，維持腸道系統平衡，從而增強腸道黏膜免疫，保護腸道健康[46]。此外，LF還能降低腸道內大腸桿菌、沙門氏菌、腸桿菌、腸球菌的水平，增加乳酸菌和雙歧桿菌等腸道益生菌的數量[47-48]，從而促進腸道微生物屏障的構建。

總的來說，LF在免疫系統調節中發揮著重要作用。LF通過作用于免疫細胞，調控免疫因子發揮抗炎作用；通過破壞細菌細胞膜的通透性，阻止細菌與細胞結合發揮抗菌作用；通過阻止病毒進入宿主細胞，增強免疫細胞活性發揮抗病毒作用；通過抑制癌細胞的增長以及促進癌細胞的凋亡發揮抗癌作用；以及通過改善腸道細胞、腸道炎癥、腸道菌群等方面維持腸道健康。正是由于LF具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多種生物活性，決定了其在機體免疫調節上的重要地位。

3 乳鐵蛋白改善神經系統

神經元是一種高度分化的細胞，是神經系統的基本結構和功能單位之一，它具有感受刺激和傳導興奮的功能。研究表明，當鐵代謝和鐵轉運相關基因突變或缺失時，會引起腦中鐵代謝紊亂，產生大量自由基[49]，導致氧化應激的發生而損傷神經系統，從而引起神經退行性病變，如阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、多系統萎縮(Multiple system atrophy，MSA)，路易氏體癡呆(Dementia with lewy body，DLB)，肌萎縮性脊髓側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，亨廷頓病(Huntington disease，HD)等。大量學者在衰老和神經退化的大腦中檢測到較高水平的鐵，這是由于這類退行性神經疾病中有不溶性蛋白聚集體的沉積，而這些聚集體會與鐵發生共域化[50]。而LF作為鐵轉運蛋白，能夠通過與鐵的螯合作用來減輕氧化應激反應和改善鐵代謝來保護神經系統，這在神經退行性疾病中被廣泛研究。Mohamed 等[51]對AD患者每日給予LF治療，3個月后發現LF通過調節p-Akt/PTEN通路，影響AD病理過程中的炎癥和氧化應激，從而達到了減輕AD病理級聯和緩解認知功能下降的效果。Martorell等[52]也發現LF可上調秀麗隱桿線蟲體內過氧化氫酶(ctl-2)和谷胱甘肽過氧化物酶(gpx-1)的基因表達，具有保護秀麗隱桿線蟲免受急性氧化應激損傷的能力。Xu等[53]在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導的PD小鼠模型中發現，hLF減輕了MPTP引起的多巴胺能神經元神經元凋亡、神經炎癥和組織學改變，同時抑制了MPTP誘導的鐵的過度積累和二價金屬轉運蛋白(DMT1)和轉鐵蛋白受體(TFR)的上調，進而提高了幾種抗氧化酶的活性，顯著改善PD小鼠運動功能障礙。

LF還是人乳中最豐富的唾液酸化糖蛋白之一，其通過促進神經元分化與成熟，可增強大腦的認知功能和學習能力。環一磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)反應元件結合蛋白(cAMPresponse element binding protein，CREB)是神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)信號通路的下游靶點，是神經發育和認知中至關重要的蛋白，研究表明，LF可以上調仔豬海馬腦源性BDNF的轉錄和翻譯水平，增加CREB磷酸化水平，并上調神經可塑性、細胞遷移和祖細胞分化的標志物以及聚唾液酸的表達，促進軸突的生長和定位[54]。其次，Sriramoju等[55]的研究發現，LF可上調神經元分化因子(β-微管蛋白III，NF68-160-200，NSE)的表達并促進神經元分化，LF通過與特異性脂蛋白受體結合進而刺激胞內磷脂酰肌醇激酶(Phosphatidylinositol kinase，PI3K)和細胞外信號調節激酶(Extracellular signaling kinase，ERK)傳導途徑對神經元分化作用進行調節。另外，Wang[56]使用豬基因芯片對來自野豬的20201個基因進行了腦海馬的全基因轉錄譜分析，發現喂食LF組與對照組相比共有1187個基因有差異表達，其中與細胞突起、微管動力學、神經突生長、細胞骨架形成以及焦慮相關的基因表達差異顯著。

總的來說，LF對神經系統的改善可分為兩方面：一方面，LF的鐵螯合功能可減輕氧化應激反應，避免鐵代謝紊亂導致的神經退行性疾病；另一方面，LF通過調節與神經發育和認知相關的幾種典型信號通路促進神經元的分化和成熟。

4 乳鐵蛋白調節糖脂代謝途徑

動物研究和臨床數據一致表明，無論是通過胃管注射還是口服LF，都可以減少肥胖小鼠和人類受試者的脂肪積累。近年來的研究進一步表明，LF可降低血漿與肝臟中甘油三酯和膽固醇含量，減少內臟脂肪積累[57]，還可有效防止高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的發生[58]。LF主要通過以下方式來調節糖脂代謝：

LF通過調節血漿中的厭食癥激素濃度，如：空腹和餐后血糖濃度、空腹血清瘦素濃度及血漿胰島素濃度等，來抑制食欲、改善能量平衡，以熱量限制的方式降低體內脂肪含量[59]。Yagi等[60]將小鼠前脂肪細胞系MC3T3-G2 / PA6放入含LF的分化培養基中培養以誘導其分化，結果表明：LF通過下調誘導脂肪細胞分化的主要調節因子——過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxidosome proliferators activate receptors-γ，PPARγ)的表達，減少脂聯素mRNA的表達，從而抑制脂肪細胞的分化。LF還能通過抑制脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶-α以及其他編碼脂質合成酶基因的表達，來抑制前脂肪細胞中的脂質積累[61]。最新研究指出，LF可通過低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LDL receptor-associated protein 1, LRP1)受體激活成熟脂肪細胞的cAMP-PKA信號通路，蛋白激酶A (Protein kinase A，PKA)磷酸化后能夠激活激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive lipase，HSL)，激活的HSL能夠從細胞質進入脂滴中，開始脂解過程[62]。另外，Nakamura等[63]在研究中進一步發現，bLF與LRP1受體作用，通過cAMP-PKA信號通路促進了棕色脂肪細胞中解偶聯蛋白1(Uncoupling protein 1，UCP1)基因的表達，該蛋白在棕色脂肪細胞的線粒體內膜上高表達并可消耗游離脂肪酸產生的能量，加快脂肪分解消耗。此外，bLF可通過調節腸道菌群、增加雙歧桿菌的數量、促進腸桿菌屬適度增長，以減少體重增加和脂肪儲存，降低血液膽固醇和葡萄糖濃度，從而調節高脂飲食誘導的肥胖小鼠的脂糖代謝紊亂[64]。Moreno-Navarrrrete等[65-66]也發現，在II型糖尿病患者血液中LF含量與空腹血糖濃度呈負相關，而與胰島素敏感性呈正相關，說明LF可能對糖代謝有一定的影響。

由此，LF調節糖脂代謝的途徑主要可歸納為：a.抑制食欲，減少能量攝入；b.抑制脂肪細胞分化與脂質積累；c.加快成熟脂肪細胞內脂肪分解；d.改善腸道環境，從而調節糖脂代謝。

5 乳鐵蛋白的其他生物活性

LF具有促進機體再生的功能以及多種酶的活性。LF對機體的再生屬性體現在兩方面：a.在骨中，LF可促進成骨細胞增殖和骨基質分泌，同時可抑制成骨細胞凋亡和破骨細胞生成[67]。如：Liu等[68]闡明了LF通過刺激ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-JunNterminalkinase，JNK)、p38蛋白以及增強c-Fos和c-Jun基因的表達來誘導MC3T3-E1成骨細胞增殖；Amini等[69]的研究表明了rhLF能夠通過Wnt5a /PKA途徑介導對MC3T3前成骨細胞的抗凋亡作用；Devescovi等[70]的實驗表明LPS與細胞表面受體結合誘導骨細胞發生骨質疏松和溶骨癥時，LF能夠通過和LPS競爭性結合來抑制LPS與細胞表面受體的相互作用，從而抑制破骨細胞的生成。此外，LF還能夠調控骨再生過程中的信號分子， Nakajima[71]發現bLF可增加小鼠成骨細胞中管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)的表達。b.在軟組織中，LF對成纖維細胞和角質形成細胞的增殖、遷移以及對細胞外基質成分(包括膠原蛋白和透明質酸)的合成有促進作用。LF能夠通過參與炎癥反應并促進皮膚肉芽和上皮形成來加快傷口愈合過程[5]。Tang等[72]利用豬燒傷創面模型研究了holo-RhLF對傷口再上皮化的影響，發現LF能夠增強角質形成細胞的增殖和遷移并抑制細胞凋亡。

此外，LF具有DNA酶、RNA酶、ATP酶、磷酸酶、淀粉酶、過氧化物酶以及蛋白酶活性。Kanyshkova等[73]發現LF在水解RNA方面比14-kDa RNA酶更活躍；與IgG和sIgA抗體相比，LF在水解ATP方面也顯示出更為活躍的特性。LF的不同配體可誘導單分子LF形成不同的特異構象，從而可調節其酶活性[74]。因此，LF是一種非常多功能的蛋白質，其多種酶活性可能會擴大其不同的生物學功能[75]，在未來研究中需深入了解。

6 乳鐵蛋白的應用

LF因具有抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化、再生屬性以及酶活性等多種生理活性，被廣泛應用于食品、動物生產、醫療、化妝品等領域，其可作為食品添加劑、保健品、免疫促進劑、藥物載體等產品被應用。

LF最早于1982年應用在嬰兒配方奶粉中，用于預防新生兒腸內感染以及促進嬰兒鐵的吸收[76]。后來其逐漸被添加在口香糖、化妝品、膠囊或飲料中用來治療和預防鐵缺乏癥、腹瀉、阿爾茲海默癥及增強抗炎癥能力等[77]。近年來，LF被列入食品添加劑[78]，將其添加到食品中以抗氧化和抑制細菌生長，如：延長大豆油等油脂的保質期。在醫療上，LF作為藥物輔助劑，與藥物協同治療以增強藥物療效和減輕機體抗藥性。目前，新興的LF產品主要有：以LF為基礎所制備的LF納米粒子，其具有良好的熱穩定性、更長的貯存時間和pH穩定性，因此LF納米粒子能作為載體在食品中起到封裝和保護鐵等微量營養素的作用[79]，并且在藥品中可起到緩釋有效成分的作用。此外，多肽作為一種新的治療手段引起了越來越多的關注，目前已有60多種多肽藥物上市，科學家們也正在加緊LF多肽的臨床研發。表1總結了國內外各行業利用乳鐵蛋白生產功能性產品情況。

表1 不同行業產品對乳鐵蛋白功效的利用[80-89]Table 1 Application of lactoferrinin different industries[80-89]

目前LF主要通過以下兩種方式獲得：其一，天然LF可以從幾種哺乳動物的乳汁和初乳中分離純化獲得；其二，利用外源基因重組技術在動植物及微生物體內表達得到LF[40,90]。據調查，提純1噸LF需要消耗至少14000噸鮮奶，因此從哺乳動物乳汁分離純化得到LF的成本十分昂貴，工藝也較為復雜。而利用細菌、真菌、植物、動物細胞系和哺乳動物等表達系統生產LF，具有成本低、產量大等優勢，在未來有望廣泛應用于醫藥及營養等領域。

7 展望

近幾十年來，日本一直將LF作為營養強化劑用于食品中，歐洲食品安全局近年也將其批準為食品成分，而在中國，LF也開始被作為食品添加劑投入生產，并通過了中國食品藥品監督管理局(CFDA)的認證[91]。LF在體內有兩種吸收方式，一種是以完整分子的形式進入體內，另一種是以分解肽段的形式被機體吸收，目前這兩種形式與其各種生理活性還無法一一對應解釋。因此需要更加深入地研究LF在動物機體的吸收、調節和作用機制，這將有助于理解LF作為食品在人體營養代謝中的關鍵作用。另外，近年來人們發現LF在脂代謝調節過程以及神經系統調節過程中發揮積極作用，但其作用方式和作用機制還并不清楚，這是未來可以繼續深入研究的方向。總之，LF作為一種安全的天然營養物質，發掘其更深層次的生理活性機制有利于各行業對其更好地利用。