鹽脅迫對菌根化沙棗幼苗生長性狀的影響1)

徐娜

(中國郵政集團有限公司黑龍江省分公司，哈爾濱，150001)

宋福強 范曉旭 隋心 常偉

(黑龍江大學)

土壤鹽漬化會改變土壤理化性質，影響植物種子萌發、生長、繁殖，從而導致植物生物量下降。全球作物每年因土壤鹽漬化減產超過20%。鹽堿地在我國分布廣泛，有接近7%的農業耕地受到鹽堿化影響，迫切需求對鹽堿地的生態修復技術。

沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)為胡頹子科多年生落葉喬木或小喬木。因為其具有耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠、抗風沙等特點，已經被列為我國荒漠沙地和鹽堿地造林綠化、土壤改良、生態改善的先鋒樹種。有關研究表明，沙棗可以在鹽質量分數為1%的鹽堿地正常生長，通過對其種子萌發、水分與滲透調節、抗氧化防御等進行測定，沙棗具有良好耐鹽性[1]。

叢枝菌根真菌(AMF)可以和80%的陸生植物建立叢枝菌根(AM)共生體，在提高植物抗逆能力、營養吸收、轉運和利用方面，叢枝菌根比單獨的植物根系更具效率[2]。許多研究表明，叢枝菌根真菌能夠通過促生長作用提高宿主植物耐鹽性。Giri et al.[3]研究表明，在鹽脅迫下，未接種叢枝菌根真菌聚生球囊霉(Glomusfasciculatum)的金合歡苗木，其根、莖的干質量顯著下降，而接種叢枝菌根真菌有效促進了金合歡苗木生長；Porras-Soriano et al.[4]研究表明，接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內球囊霉(Glomusintraradices)、近明球囊霉(Glomusclaroideum)3種叢枝菌根真菌，能夠提高橄欖植株苗木在鹽脅迫條件下的生長；Latef et al.[5]研究表明，在鹽脅迫下，與非接種處理相比，接種叢枝菌根真菌的番茄具有更高根莖葉的干質量，更大葉面積和總生物量；另外，Khalil et al.[6]研究表明，在更高鹽脅迫下，接種根內球囊霉的柑橘具有更高生物量；Borde et al.[7]研究表明，在適度鹽脅迫下，接種聚生球囊霉可顯著提高御谷(Pennisetumglaucum)的葉片數、莖長、根長。叢枝菌根真菌能夠有效提高宿主植物在鹽脅迫下的生物量，原因在于叢枝菌根真菌能夠增強宿主植物氮、磷、鉀等營養獲取能力，改善了宿主植物在鹽脅迫條件下的生長生理狀態。與單純使用耐鹽植物不同，作為一種環境友好、經濟高效可行的鹽堿地治理新手段，叢枝菌根真菌技術在全球可持續農業和環境保護方面應用的巨大潛力已經受到國內外研究人員廣泛關注。但是，目前關于叢枝菌根真菌是否能進一步提高耐鹽植物的抗性，報道較少。本研究以實生沙棗苗木為供試植物、異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)為供試菌株，采用盆栽培養方法，設置不同濃度的NaCl脅迫菌根化沙棗幼苗，測定不同濃度NaCl脅迫的菌根化沙棗幼苗的株高、基徑、生物量、功能葉片生長參數、鹽害癥狀，分析鹽脅迫對菌根化植物生長的影響，旨在為利用耐鹽植物聯合菌根生物技術進行鹽堿地生物治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試沙棗(E.angustifoliaL.)品種錦繡1號，由黑龍江錦繡大地生物工程有限公司提供，該品系于2011年經黑龍江省林業廳鑒定，具有較強的耐鹽堿和耐寒能力。

供試叢枝菌根真菌(AMF)菌種：選擇能夠提高宿主植物耐鹽性的異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)，獲批專利ZL201510232876.3，菌劑中叢枝菌根真菌孢子量為25～30個/g。由黑龍江大學修復生態研究室篩選、擴繁及保存。

苗木培養基質的土壤，取自黑龍江省森林植物園(地理中心坐標：東經126°16′、北緯45°45′)。土壤過直徑5 mm篩，按體積比與蛭石混合均勻(V(土壤)∶V(蛭石)=3∶1)，經3次高溫高壓滅菌(0.1 MPa，121 ℃，1 h)處理，等量分裝至花盆(規格為33 cm×16 cm×15 cm)中。培養基質初始性質：pH=7.2，有機質質量分數1.2%，有效氮質量分數123.4 mg/kg，有效磷質量分數12.6 mg/kg，有效鉀質量分數76.5 mg/kg，電導率0.5 dS/m。

1.2 試驗方法

采用完全隨機區組試驗，包含2個因素：叢枝菌根菌劑接種處理，不接種的對照處理(NM)、異形根孢囊霉接種處理(M)；NaCl脅迫處理，0、100、200、300 mmol·L-1NaCl。每個處理6個生物學重復(見表1)。

表1 菌根化沙棗苗木盆栽鹽處理試驗設計

沙棗種子用質量分數的0.2%的KMnO4溶液表面消毒處理10 min，無菌蒸餾水潤洗4次，播種于花盆中。叢枝菌根菌劑接種處理，接種量10 g/盆；對照處理，每盆接10 g滅活叢枝菌根真菌菌劑。定期檢測叢枝菌根真菌侵染情況，當菌根侵染率達到90%以上時進行NaCl脅迫處理。為避免對苗木產生滲透休克，分2次進行鹽脅迫處理，間隔期7 d，每次每盆施鹽溶液1.5 L。完成鹽脅迫后的30 d取樣，用于各項指標測定。

菌根侵染率測定：參考采用醋酸墨水染色法將根段染色[8]，依據特魯夫洛(Trouvelot)的方法[9]計算菌根侵染率，菌根侵染率=(有菌根根段數/總根段數)×100%。

株高、基徑測量：每個處理中隨機選取沙棗苗木20株，以米尺測量株高(精確至0.1 cm)，用游標卡尺測定基徑(精確至0.01 mm)。

生物量積累與分配：每個處理中隨機選取沙棗苗木20株，將單株沙棗苗木根、莖、葉分別收集，105 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘干至恒質量，自然冷卻；電子天平稱量沙棗苗木根、莖、葉的干質量(精確至0.001 g)，計算全株總生物量、冠生物量、生物量分配比例。全株總生物量=根的干物質量+莖的干物質量+葉的干物質量；冠生物量=莖生物量+葉生物量；生物量分配比例=(各組織生物量/相應處理植株的平均總生物量)×100%。

葉片參數調查和測定：隨機選取每個處理沙棗苗木20株，計數每株苗木的脫落葉片數量、枯黃葉片數量、完全展開功能葉片數量。其中，已經脫落或輕微觸碰而脫落的葉片為脫落葉片，除全綠和僅葉尖枯黃以外的完全展開葉片為枯黃葉片，面積≥1 cm2的完全展開葉片為功能葉片。葉片脫落率=[脫落葉數/(脫落葉數+枯黃葉數+功能葉數)]×100%；葉片枯黃率=[枯黃葉數/(脫落葉數+枯黃葉數+功能葉數)]×100%；葉片鹽害率=[(脫落葉數+枯黃葉數)/(脫落葉數+枯黃葉數+功能葉數)]×100%。

將每個處理的20株完全展開的葉片分單株收集于自封袋內。用掃描儀掃描葉片，根據葉面積計算軟件(1.1版本)，計算各單株的總葉面積，記錄葉片數量，并計算單葉面積、比葉面積、葉面積比率。單葉面積=總葉面積/總葉數；比葉面積=總葉面積/葉片的干物質量；葉面積比率=總葉面積/全株的干物質量。

數據處理與統計方法：采用Microsoft Excel 2003、GraphPad Prism 6.0軟件進行數據處理。相同鹽濃度脅迫處理的叢枝菌根真菌接種(M)和非接種(NM)處理之間的差異性，用獨立樣本t檢驗分析(P<0.05)。不同鹽濃度脅迫處理之間的差異性，用單因素方差分析中的鄧肯檢驗分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對沙棗幼苗的侵染

異形根孢囊霉能夠侵染并定殖于沙棗苗木根部。沙棗苗木接種異形根孢囊霉3個月后，菌根侵染率均達到90%以上，經顯微鏡鏡檢觀察，可清晰觀察到沙棗菌根根內菌絲、泡囊和叢枝結構(見圖1)。

圖1 沙棗菌根根內菌絲、泡囊和叢枝顯微結構

2.2 鹽脅迫對菌根化沙棗苗木株高和基徑的影響

經過30 d鹽脅迫，無論是否接種叢枝菌根真菌，鹽脅迫均對沙棗苗木生物量產生明顯抑制作用，顯著降低沙棗苗木株高、基徑(P<0.05，見表2)。鹽濃度為100、200、300 mmol·L-1時：M處理、NM處理的沙棗苗木，株高總體均呈下降趨勢，接種叢枝菌根真菌顯著提高沙棗苗木的株高(P<0.05)，增加幅度分別為9.68%、13.53%、11.30%；M處理、NM處理的沙棗苗木，基徑均呈顯著下降趨勢(P<0.05)，接種叢枝菌根真菌顯著提高沙棗苗木的基徑(P<0.05)，增加幅度分別為7.79%、6.67%、4.35%。

表2 經鹽脅迫和接種叢枝菌根真菌的沙棗苗木株高和基徑

2.3 鹽脅迫對菌根化沙棗苗木生物量的影響

經過30 d鹽脅迫，無論是否接種叢枝菌根真菌，鹽脅迫均對沙棗生物量產生明顯抑制，根、莖、葉的干質量和總生物量均在最高濃度鹽脅迫時最低；但同一鹽濃度處理時，M處理沙棗苗木生物量顯著高于NM處理的(見表3)。

在無鹽脅迫時，接種叢枝菌根真菌顯著提高沙棗苗木根生物量、莖生物量、葉生物量、冠生物量、全株總生物量(P<0.05)，其中根的干質量增加19.05%、冠生物量增加24.44%、全株總生物量增加23.86%。

隨著濃度升高的鹽脅迫，M處理、NM處理沙棗苗木根的干質量均顯著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫時，M處理沙棗苗木根的干質量與無鹽脅迫處理的相比，分別降低16.00%、34.00%、 52.00%。相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木根的干質量均顯著高于NM處理的，分別增加23.53%、26.92%、100.00%。

隨著鹽脅迫程度提高，M處理、NM處理沙棗苗木冠生物量均顯著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理時，M處理沙棗苗木冠生物量比無鹽脅迫沙棗苗木冠生物量，分別降低15.48%、37.50%、60.12%。相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木冠生物量均顯著高于NM處理的。100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理時，M處理沙棗苗木冠生物量比NM處理的，分別增加39.22%、64.06%、109.38%。

隨著鹽濃度不斷提高，M處理、NM處理沙棗苗木全株總生物量均顯著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，M處理沙棗苗木全株總生物量比無鹽脅迫的，分別降低15.60%、37.16%、58.72%。相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木全株總生物量均顯著高于NM處理的，100、200、300 mmol·L-1NaCl濃度處理時，分別增加了36.30%、52.22%、104.54%。

2.4 鹽脅迫對菌根化沙棗苗木功能葉生長的影響

無鹽脅迫時，接種叢枝菌根真菌顯著提高了沙棗苗木單葉面積、比葉面積、葉面積比率(P<0.05)，分別增加了27.86%、14.91%、15.58%(見表4)。

M處理、NM處理沙棗苗木，均隨著鹽脅迫程度加劇顯著降低了苗木單葉面積、比葉面積、葉面積比率(P<0.05，見表4)。其中，100、200、300 mmol·L-1鹽脅迫處理時，M處理沙棗苗木單葉面積比無鹽脅迫的，分別降低22.37%、41.44%、63.81%。相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木單葉面積均顯著高于NM處理的(P<0.05)，100、200、300 mmol·L-1鹽脅迫處理時，分別增加19.46%、40.65%和138.46%。

100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，M處理沙棗苗木的比葉面積，比無鹽脅迫的分別降低26.10%、42.50%、63.32%；相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木比葉面積均顯著高于NM處理的(P<0.05)，分別增加3.37%、34.96%、30.90%。

100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，M處理沙棗苗木葉面積比率，比無鹽脅迫的分別降低28.51%、42.91%、58.01%；相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木葉面積比率均顯著高于NM處理的(P<0.05)，分別增加6.94%、51.48%、130.27%。

經過30 d鹽脅迫，對不同濃度鹽脅迫處理的沙棗苗木葉片受害情況進行統計(見表5)，在無鹽脅迫時，M處理、NM處理沙棗苗木下部老葉均出現一定程度脫落、枯黃。隨著濃度升高的鹽脅迫，M處理、NM處理的沙棗苗木植株，葉片脫落率、枯黃率、鹽害率總體上均呈現顯著升高趨勢(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，導致M處理沙棗苗木葉片脫落率、枯黃率、鹽害率均顯著升高，各濃度鹽處理之間呈顯著差異(P<0.05)。相同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木葉片脫落率、枯黃率、鹽害率均顯著低于NM處理的(P<0.05)。

表5 經鹽脅迫和接種叢枝菌根真菌的沙棗苗木葉片脫落率和枯黃率

3 討論

鹽脅迫會顯著抑制植物生長，因此，植物面臨鹽脅迫時，自身是否能夠維持正常生長狀態是衡量其耐鹽能力的重要指標之一。叢枝菌根真菌能夠幫助植物改善生長生理狀態，緩解鹽脅迫壓力[10]。本研究表明，在同等鹽脅迫條件下，接種異形根孢囊霉顯著改善沙棗苗木生長狀態，提高了株高、基徑、根生物量、莖生物量、葉生物量、冠生物量、總生物量，通過維持較高生物量，有效稀釋Na+等有害鹽離子濃度，減弱了鹽脅迫對植物毒害作用。鹽脅迫時，菌根沙棗苗木表現出更高生物量，這與國內外已發表的諸多叢枝菌根真菌-植物共生體耐鹽脅迫研究結果相一致[11-12]。

根系是植物吸收水分和營養成分的重要器官。植物根系是與鹽堿、干旱、重金屬等外源非生物脅迫因子最直接關聯的器官組織，鹽脅迫能抑制植物根系生長，降低植物根系表面積。叢枝菌根真菌通過與宿主植物根系結合，建立共生體系后，會促進根系發育，改變植物根系構型，增加根系生物量。因此，叢枝菌根真菌能夠促進植物生長，與其促進根系發育、改善宿主植物根系形態特征有著密不可分的關系。目前諸多研究結果已經證實，為了更有利于宿主植物吸收水分、營養物質，菌根化植物往往具有更發達根系，以維持光合作用和生物量積累[3，5，13-14]。本研究中，鹽脅迫顯著降低了沙棗苗木根的生物量，接種異形根孢囊霉提高了沙棗苗木根系生物量，促進了根系生長，這有利于植物更好地適應鹽脅迫。

植物受鹽脅迫，導致葉面積減小，伴隨莖生長減緩，光合速率降低，繼而降低整體生物量。本研究中，鹽脅迫時，M處理沙棗苗木冠生物量下降幅度小于NM處理的，表明接種異形根孢囊霉有效緩解了鹽脅迫對莖葉生長的抑制作用，菌根化沙棗苗木對鹽脅迫的耐受能力更強。

葉片是植物光合作用的重要器官組織，單葉面積指標與生物量積累能力密切相關，比葉面積、葉面積比率能夠衡量植物在不同生境的環境資源獲取能力。本研究中，在不同濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木單葉面積下降幅度小于NM處理的，并且在相同濃度鹽脅迫時，菌根化沙棗苗木單葉面積顯著高于非菌根化沙棗苗木的；且菌根化沙棗苗木比葉面積、葉面積比率，顯著高于相同鹽處理的非菌根化沙棗苗木的，這表明，鹽脅迫的菌根化沙棗苗木具有更強光合作用能力，以提高生物量積累。植物葉片脫落、枯黃狀態是鹽脅迫的植物生長狀態最直接體現，本研究中，高濃度鹽脅迫時，M處理沙棗苗木葉片脫落率、枯黃率、鹽害率顯著低于NM處理的，說明接種異形根孢囊霉在一定程度上緩解了鹽脅迫對沙棗苗木植株的生長抑制效應。

本研究表明，接種叢枝菌根真菌異形根孢囊霉，不但對鹽脅迫的沙棗幼苗的生長具有明顯的促進作用，而且還可以增強其耐鹽脅迫能力。這可為鹽堿地資源開發利用和綜合生態治理、把黑龍江省現有鹽堿地變成綠洲、對沙棗這一林業潛在資源進行后期產業開發提供參考。