重組人生長激素給藥系統的研究進展

李瑤，巨曉潔，2，汪偉，2，劉壯，2，謝銳，2，褚良銀，2

（1四川大學化學工程學院，四川成都610065；2四川大學高分子材料工程國家重點實驗室，四川成都610065）

生長激素（growth hormone，GH）是由人腦垂體分泌的一種單鏈多肽分子，通過促進軟骨細胞增殖和蛋白質合成以及調節體內糖、脂肪和微量元素等物質代謝，保證人體的正常生長發育[1]。兒童生長激素分泌不足會導致身材矮小。生長激素缺乏癥（growth hormone deficiency，GHD）是兒科臨床常見的內分泌疾病之一[2]。20世紀80年代末期，研究者們利用基因重組技術，獲得了氨基酸序列及組成與天然人生長激素完全相同的重組人生長激素（recombinanthuman growth hormone，rhGH），逐漸成為治療各種生長激素缺乏癥及并發癥的首選藥物。rhGH發展至今三十余年，其用途已不再局限于治療兒童生長激素缺乏癥，在臨床上也被應用于特納綜合征（Turner syndrome）[3-4]、充血性心力衰竭[5-6]、慢性腎功能不全[7-8]和嚴重燒傷[9-10]等疾病。

作為一種多肽分子，rhGH存在穩定性差、易失活或分解、體內半衰期短等問題。目前臨床使用的rhGH凍干粉針制劑或水針制劑均需長期頻繁皮下或肌肉注射給藥，注射部位常出現疼痛紅腫、皮下硬結和脂肪萎縮等副作用[11]，導致患者尤其是兒童患者依從性極差。在制劑生產和運輸過程中，rhGH分子也容易受不當干燥方式[12]和路途顛簸[13]等因素的影響而失去藥物活性。因此，開發新型rhGH給藥系統有著極其重要的研究意義和臨床價值。國內外研究者們在該領域進行了大量研究工作，主要包括兩個方向：①通過對rhGH進行化學修飾、構建融合蛋白、構建rhGH緩釋微球給藥系統等方法，延長rhGH體內半衰期，實現長效治療，降低注射頻率；②開發rhGH新型給藥方式以避免注射，主要包括經皮給藥、肺部給藥和鼻腔黏膜給藥。已有相關文獻對rhGH制劑的研發狀況進行了綜述，但發表時間較早[14-15]，僅是將可實現rhGH長效化的各類方法羅列出來[16]，并未對rhGH分子進行修飾和改變其給藥途徑兩大類進行區分。本文從rhGH長效化制劑和非注射給藥途徑兩個方面，綜述了其類型、有效性以及潛在的問題，以期使讀者能夠更全面、更清楚地了解該領域的研究狀況；并對該領域的未來研究提出了發展方向，以期為進一步開發安全有效的rhGH新型給藥系統提供參考。

1 rhGH長效制劑

rhGH長效制劑可以通過增加蛋白類藥物的體內循環時間改善其藥代動力學和藥效學性質、延長其半衰期等方式，在1周至超過1個月的時間內直接降低注射頻率[17]。目前研究較多的rhGH長效化方法主要包括對rhGH進行化學修飾[18]、構建融合蛋白[19]和構建緩釋微球給藥系統[20]。

1.1 化學修飾

對rhGH進行化學修飾，增加其分子量、表觀尺寸等理化性質，可以降低rhGH的腎臟清除率，延長其體內半衰期，實現長效治療。在已報道的化學修飾技術中，研究最多的是利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）及其衍生物通過共價鍵方式對rhGH進行結構修飾。這是由于PEG是一種具有生物惰性且無免疫原性的線性大分子聚合物，對rhGH進行PEG化修飾[21]，可以避免rhGH被網狀內皮系統攝取，并且其經腎臟過濾后，清除率較低。PEG分子可以和rhGH分子中10個賴氨酸殘基進行不同程度的偶聯，其中有4個位點處于rhGH與受體的結合部位，直接影響rhGH的生物活性[22]，并且，rhGH體內半衰期隨著PEG偶聯數量增多相應延長，但其與受體結合的活性將急劇下降[23]。因此，研究者們從PEG的分子量、修飾位點、結構類型（如分支型或支鏈型）、偶聯數量等方面開展研究，以期在改善rhGH長效性能的同時保留其藥物活性。近年來，已有多家制藥公司相繼開展了PEG化rhGH的研發工作，如表1所示。

表1 PEG修飾rhGH研究

de Schepper等[24]研發了一種末端修飾PEG的rhGH（NNC126-0083）期望針對患有GHD的兒童實現每周一次給藥，并系統探究了此單劑量PEG化rhGH的安全性、耐受性、藥代動力學和藥效學性質，30名兒童受試者在臨床研究中未發現短期安全性或局部耐受性問題。血清胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）常用于rhGH制劑治療的療效評價和安全性檢測[25]，在所有NNC126-0083試驗組中均觀察到了IGF-Ⅰ水平升高，但注射3天后，IGF-Ⅰ反應開始下降，并不是如預期的那樣持續一周，因此IGF-Ⅰ結果并不令人滿意。

Jintrolong?是我國長春金賽藥業研發的PEG化rhGH長效制劑，為rhGH與分支型PEG組成的共價偶聯物。在I期臨床試驗中，患有GHD的兒童單次給藥后，IGF-Ⅰ水平升高并能持續一周，與每日持續注射rhGH沒有顯著差異[26]。在對健康成人進行單劑量給藥的耐受性試驗和藥代動力學試驗中[27]，在測試的所有劑量水平下，受試者均表現出良好的耐受性，并具有更長的半衰期和較低的血漿清除率，且無明顯的rhGH蓄積。Jintrolong?的多劑量藥物代謝動力學試驗的安全性和有效性，也在Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗中得到了肯定[28]。Jintrolong?于2014年被原國家食品藥品監督管理總局（SFDA）批準上市，成為全球首支上市的PEG化學修飾的長效rhGH注射液。

PEG化修飾rhGH技術已經較為成熟，但仍然存在一些問題。例如，對rhGH進行PEG修飾時，可被修飾的位點較多，從而增大了純化難度，增加了生產成本[32]；PEG化修飾在延長rhGH體內作用時間的同時會阻礙其與受體的結合，使rhGH活性降低[23]；臨床前靈長動物研究發現，PEG在脈絡叢上皮細胞中有積聚現象[16]。并且，近期研究表明，rhGH長效制劑在治療期間IGF-Ⅰ升高可能與胰島素敏感性受損有關[33]，將來的研究工作應更多地關注大劑量rhGH長效制劑治療安全性的隨機對照試驗，尤其是檢測血清IGF-Ⅰ水平升高引起的不良反應。

1.2 融合蛋白

盡管PEG修飾的rhGH不受腎小球濾過的影響，但仍能和腎內GH受體結合，經過胞吞作用被蛋白酶完全或部分代謝[19]，從而影響治療效果。通過基因工程等技術，選用半衰期較長、分子量較大的蛋白分子為載體與rhGH構建具有雙重功能的融合蛋白，可以減少rhGH與受體的結合數量，降低受體介導的清除效應。國內外多家制藥公司對rhGH融合蛋白開展了研發，包括將rhGH與白蛋白、免疫球蛋白片段、GH受體的細胞外GH結合蛋白片段、人絨毛膜促性腺激素（HCG）C端肽等融合，如表2所示。

表2 rhGH融合蛋白研究

Kim等[43]將rhGH與免疫球蛋白G的Fc片段（IgG Fc）進行融合，制備了一種rhGH-Fc融合蛋白，較大的表觀尺寸抑制了Fc融合蛋白從血液向血管外組織轉運，降低了腎臟清除率。胞吞后，該融合蛋白在內涵體的酸性pH條件下可與新生兒Fc受體（FcRn）結合，并在血液的堿性pH下釋放，實現Fc融合蛋白的再循環，進一步延長rhGH的半衰期[44]。對雄性SD大鼠和垂體切除SD大鼠進行皮下注射rhGH-Fc，評價其藥代動力學和藥效學，結果表明，單次皮下注射rhGH-Fc在一周內持續緩慢釋放，半衰期延長至51.1h，并能引起大鼠體重的快速增加和脛骨寬度的增長，間隔一周兩次注射rhGH-Fc的效果與每天注射相同劑量的rhGH效果相當。GX-H9是將rhGH融合到由人免疫球蛋白D（IgD）和人免疫球蛋白G4（IgG4）組成的復合Fc片段中制備得到的新型rhGH長效化制劑，臨床試驗中，45例接受或未接受rhGH治療的GHD患者在3個月的GX-H9給藥期結束時，均觀察到GX-H9的rhGH總釋放量與劑量的增加成比例，平均IGF-I反應維持在基線之上，同時顯示出可接受的耐受性，并且沒有顯著的免疫原性[35]。

Somapacitan是一種新型的長效rhGH，通過將小分子結合白蛋白（1200）以非共價方式附著在rhGH上，通過促進其與內源性白蛋白的可逆結合，延遲rhGH的消除效應，從而延長作用時間。短期試驗表明，每周一次Somapacitan皮下注射給藥，在健康的成年人[45]以及患有GHD的成年人和兒童[46]中，均顯示出良好的耐受性，在GHD兒童中表現出與每日皮下注射rhGH相似的療效。在7個國家的16個內分泌中心進行的Ⅲ期臨床試驗結果表明，Somapacitan可使腹部脂肪減少、骨骼肌增加，不良事件僅與注射部位反應有關，其總體治療效果與每日注射rhGH替代治療的效果一致[46]。

rhGH通過細胞表面的Ⅰ型細胞因子受體（growth hormone receptor，GHR）發揮作用，在生理條件下，rhGH與其受體的胞外域結合蛋白片段（growth hormone binding protein，GHBP）的交聯復合物沒有生物學活性但能延緩清除。Wilkinson等[41]將rhGH與GHBP融合得到了一種有效且作用持久的rhGH長效制劑ProFuse GH。其分子模型及受體激活示意圖如圖1所示，該融合蛋白形成了一個首尾相接的二聚體結構，它為rhGH及其結合蛋白提供了一個天然的儲備庫，并在以單體形式融合能夠結合并激活GHR。在大鼠中，與天然rhGH相比，ProFuse GH的清除率大約是其1/300，單次注射可在10天內持續發揮促生長作用。

圖1 分子模型及采體激活示意圖[41]

融合蛋白在保留治療性蛋白生物活性的同時也具有一些抗體的性質，rhGH融合的蛋白片段是否會導致一些尚未發現的細胞毒性等副作用仍需要在研究的過程中進行長期監測。除此之外，融合蛋白表達量低、分離純化復雜、價格高昂等問題也限制著其進一步發展。

1.3 緩釋微球

隨著生物可降解材料的快速發展，新型藥物微球緩控釋系統逐漸興起。將蛋白類藥物吸附或分散在可生物降解的高分子材料中，制備成粒徑為1～300μm的球狀微粒，在體液的溶蝕作用和藥物濃差推動作用下，可以實現蛋白類藥物的緩慢釋放[48]。目前已研究報道的rhGH緩釋微球主要以乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）[49]、聚乳酸（PLA）[50]、透明質酸（HA）[51]等高分子作為微球骨架材料。

美國Genentech公司曾上市了第一個將rhGH包載在PLGA微球中的rhGH長效緩釋制劑Nutropin DepotTM[52]，可實現一個月的持續釋放。但后續研究發現其注射部位會產生硬結、紅斑，并且PLGA在體內降解為乳酸和羥基乙酸，但酸性降解產物會使局部微環境pH降低，易造成rhGH失活和釋放不完全，同時由于生產成本高等問題，Nutropin DepotTM于2004年退市[53]。Wang等[54]采用水/油/水乳液-溶劑蒸發法將聚縮酮PCADK與PLGA共混，制成了具有較大孔洞的PCADK/PLGA微球，這些大孔洞有利于酸性物質的排出和緩沖液的進入，可以改善微球內部由于PLGA降解所產生的酸性環境，載有rhGH的PCADK/PLGA微球在去垂體大鼠體內能釋放兩周時間，并顯示出比純PLGA微球更強的IGF-Ⅰ濃度響應，rhGH生物利用度得到明顯提高。然而，大的孔洞必然導致溶劑蒸發過程中rhGH容易從微球中逸出，因此PCADK/PLGA微球中rhGH包封率并不夠理想。除此之外，PLGA微球負載rhGH后粒徑通常較大（50～60μm），無法在注射介質中有效懸浮，也無法通過細針注射。

HA是一種具有高度生物相容性和可生物降解性、安全無毒、無抗原性的天然高分子，且沒有類似PLGA降解造成的給藥缺陷，是蛋白多肽類藥物理想的載體材料[55]。Kim等[51]采用噴霧干燥技術制備了一種載有rhGH的HA緩釋微顆粒（SRrhGH），也被稱為LB03002，載藥量可達20%，其平均粒徑約為5μm，因此懸浮液的注射體積較小，可以很容易地使用26號針頭注射。動物實驗表明，SR-rhGH一次給藥后，可誘導食蟹猴IGF-Ⅰ水平持續升高6天。為期3年的臨床研究表明，青春期前未經治療的GHD兒童皮下注射SR-rhGH［0.5～0.7mg/(kg·周)］，與每日皮下注射rhGH相比，具有相似的療效和更高的安全性[56]。隨后韓國進行了Ⅱ期臨床研究，確定SR-rhGH可以用于治療青春期前兒童特發性矮小癥時，注射劑量為0.7mg/(kg·周)，每日體內釋放rhGH不低于0.05mg/kg[57]。2007年，韓國食品藥品管理局（KFDA）批準了這種以HA緩釋微球為載體的rhGH長效制劑Declage?上市。

緩釋微球系統是實現rhGH長效化的有效途徑之一，但是由于微球的粒徑小、比表面積高，緩釋微球制劑普遍存在釋藥初期藥物突釋等問題[58-59]，研究者們還應進行更深入的研究，以獲得更好的緩控釋效果。

2 非注射給藥途徑

雖然上述rhGH長效化技術獲得了較好的長效治療效果，但這些rhGH長效制劑仍然局限于注射給藥，長期注射所帶來的各種問題仍然無法解決。為了提高患者的依從性，一些非侵入型的rhGH自主給藥途徑受到了研究者們的關注。目前，研究最多并行之有效的新型給藥途徑主要包括經皮給藥[60]、肺部給藥[61]和鼻腔黏膜給藥[62]。

2.1 經皮給藥

經皮給藥具有方便安全、可控釋藥、血藥濃度穩定等特點，在藥物遞送領域具有顯著優勢和應用潛力。蛋白類藥物由于具有相對較大的分子尺寸，很難直接跨過皮膚角質層屏障而被吸收[63]，為了解決這一問題，研究者們開發了包括使用微針技術[64]、離子導入[65]、吸收促透劑[66]和超聲導入[67]等各種經皮給藥促透技術，促進蛋白類藥物的經皮吸收。

Yang等[68]將醛改性HA與rhGH的N端氨基通過偶聯反應合成了一種共軛化合物HA-hGH，開發了一種利用受體介導的hGH經皮給藥系統，HA-hGH的化學結構式和其經皮給藥過程如圖2(a)所示。與HA結合后，hGH的二級結構保持不變。熒光顯微鏡下，可以清楚地觀察到用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的HA-hGH在小鼠背部經皮給藥后，HA-hGH有效地滲透到了皮膚真皮層，經皮滲透能力顯著增強。

微針陣列是一種高效的經皮促透技術，可以無痛地穿透皮膚角質層，形成對皮膚無損傷的微米級孔道，藥物通過孔道直接遞送至真皮層進入體循環，顯著提高了藥物的經皮吸收效率，改善了患者的用藥依從性，特別適用于生物大分子藥物的體內高效遞送。目前，研究者利用微針陣列介導rhGH經皮給藥已進行了初步嘗試，采用可生物降解或可溶解的聚合物材料制成可溶性微針陣列，該類微針陣列具有生物相容性好、不易斷裂、載藥量大等優點[69]。Lee等[70]利用羧甲基纖維素和海藻糖制成了一種可溶性微針陣列，用于介導rhGH經皮給藥，SD大鼠經皮給藥的數據表明，在約170μg的給藥劑量下，rhGH的絕對生物利用度為71%，但是，該微針陣列整體負載rhGH，微針未刺入皮膚的部分溶解不完全，造成給藥劑量不準確。Fukushima等[71]分別使用硫酸軟骨素、葡聚糖、透明質酸、白蛋白等水溶性生物高分子制成針尖負載rhGH的可溶性微針陣列，如圖2(b)所示，微針中的rhGH在4℃下可以穩定1個月，但是，該載藥針尖整體在體內快速溶解，遞送入體內后在不超過4h內即從血漿中被消除。Gyubin等[72]將微針陣列技術和離子導入技術聯合應用，設計制造了一種新型rhGH經皮給藥裝置Tappy Tok Tok?，如圖2(c)所示。實驗結果表明，離子導入對rhGH通過微針形成的微通道透皮滲透有較大的促進作用，但該裝置設計復雜、操作不便，不利于自主給藥。

圖2 經皮給藥系統開發及裝置示意圖

盡管利用微針陣列實現rhGH經皮緩慢釋放的研究尚未見報道，部分患者在給藥部位還會出現輕微紅斑，微針陣列經皮給藥仍是最有望替代rhGH常規注射的新型給藥方式，其療效需要在臨床試驗中進一步驗證。

2.2 肺部給藥

早期研究表明，將rhGH直接注入到成年大鼠下呼吸道中，通過肺后生物利用度可達36%[73]，這顯示出了肺作為rhGH給藥途徑的潛力。然而在此種給藥方式下，隨著劑量增加rhGH會在血液中逐漸達到飽和，生物利用度降低。隨后，rhGH被制成溶液氣霧劑[74]、干粉[75]等劑型用于肺部給藥。

Jalalipour等[76]在利用噴霧干燥技術制備可吸入型rhGH粉末的過程中，使用不同摩爾比的二甲基-β-環糊精（DM-β-CD）探究其對rhGH聚集的保護作用，并評估了該可吸入型rhGH粉末在SD大鼠體內全身性遞送rhGH的功效。隨著DM-β-CD濃度增加，rhGH聚集率從9.67%降低至0.84%，說明DM-β-CD可有效防止rhGH團聚，達到更好的肺部給藥效果。SD大鼠體內研究顯示，當rhGH與DM-β-CD摩爾比為10、100和1000時，其肺部給藥絕對生物利用度分別為25.38%、76.52%和63.97%。在之后的臨床試驗中，兒童吸入該rhGH粉末也表現出良好的耐受性，血清rhGH和IGF-Ⅰ水平均呈劑量依賴性增加[77]。

目前來看，rhGH肺部給藥途徑是一種安全可行的方式，但其仍處于臨床試驗或實驗室研究階段。這是由于肺部給藥對rhGH的粒徑和粒徑分布要求較高，當顆粒粒徑大于3nm時吸收較差，同時粒徑分布不均勻則會造成rhGH吸入過程中的損失[78]。除此之外，長期肺部給藥可能導致肺纖維化等副作用[79]。

2.3 鼻腔黏膜給藥

鼻腔黏膜由于具有黏膜層薄、有效吸收面積大、蛋白水解酶濃度低等性質而成為蛋白類藥物的有效給藥途徑之一[80]。鼻腔黏膜給藥后，rhGH可以通過黏膜中豐富的毛細血管直接進入血液循環系統，避免肝臟首過效應，但鼻腔黏膜纖毛的清除作用限制了rhGH吸收，通常需加入各種吸收促進劑來增加吸收。

Baldwin等[81]使用tauro-24,25-二氫夫西地酸鈉作為吸收促進劑增強rhGH鼻腔黏膜吸收，在大鼠、兔和綿羊三種動物模型中均觀察到相比對照組更高的生物利用度，但之后的人體試驗表明，與皮下注射rhGH相比，其絕對生物利用度極低（1.6%～3.0%）[82]。含環糊精和雙癸酰基-L-α-磷脂酰膽堿（DDPC）的rhGH鼻腔黏膜給藥制劑在家兔體內的生物利用度可達20%，但其主要轉運途徑是致死鼻纖毛細胞后透過鼻黏膜吸收，存在對鼻腔黏膜的嚴重損害[83]。

在已研究的各種rhGH鼻腔黏膜吸收促進劑中，必需脂肪酸（EFAs）是一種安全性極好的天然吸收促進劑[84]?；贓FAs開發的PheroidTM是一種具有微米或亞微米脂類結構的給藥系統，由獨立的水相和一氧化二氮氣相組成，其分散結構的形態、大小和功能都可以根據藥物吸收特性進行調控以滿足適應證需求。PheroidTM最主要的兩種結構為微囊和微海綿，如圖3所示，微囊具有脂質雙層膜結構，包裹一個親水中心，直徑范圍在0.5～1.5μm；微海綿包含各種小儲庫，直徑范圍在1.5～5μm，兩種結構均能將親水性化合物截留在中心而將疏水性化合物截留在膜中[85]。Steyn等[86]研究了N-三甲基殼聚糖（TMC）和PheroidTM微囊對rhGH鼻腔黏膜吸收的增強作用，結果顯示，PheroidTM微囊和高分子量、低季銨化程度的TMC可使rhGH生物利用度分別高達128.5%和136.1%，都有可能成為安全有效的rhGH鼻腔黏膜吸收促進劑。而針對不同結構的PheroidTM，微囊鼻腔黏膜遞送rhGH的絕對生物利用度遠高于相同實驗條件下的微海綿[87]。但是，吸收促進劑對鼻腔黏膜始終存在一定的毒性作用，其與rhGH的各種作用機制也仍待研究，rhGH鼻腔黏膜給藥還需要進行進一步的臨床試驗來評估長期使用的安全性。

圖3 PheroidTM的兩種結構[85]

3 結語

對于rhGH新型給藥系統，PEG化學修飾、構建融合蛋白和緩釋微球等長效化方法可以有效增加rhGH的體內循環時間，改善其藥代動力學和藥效學性質，獲得較好的長效治療效果。新型的經皮給藥、肺部給藥和鼻腔黏膜給藥等非注射型給藥途徑，可以規避長期注射帶來的注射部位紅腫、皮下硬結和脂肪萎縮等問題。但同時要注意，PEG修飾rhGH易造成蛋白質活性降低緩釋微球常存在初期突釋現象，且融合蛋白的安全性尚未證實，而非注射給藥途徑中，肺部給藥和鼻腔黏膜給藥對制劑性能要求較高，經皮給藥的緩釋性能仍需要進一步研究?？傊?，在研究rhGH體內遞送時，需要綜合考慮較高的日需劑量、患者依從性、長期治療的安全問題以及批量化生產用于商業推廣的可行性。目前雖然已經有商品化rhGH長效注射制劑在一些國家獲得了上市許可，但頻繁注射給藥帶來的各種問題仍未得到解決。將rhGH長效化與非注射給藥途徑合理結合應成為將來實現rhGH高效遞送的重要研究方向。例如將rhGH長效化制劑負載于聚合物微針陣列進行經皮無痛遞送，在延長rhGH半衰期的同時也能極大地提高患者依從性。相信隨著科學進步，研究者們必然會開發出優于傳統頻繁注射給藥的rhGH給藥系統，最大限度地發揮rhGH治療的促生長作用及其他生理益處，這也將為其他替代治療型蛋白類藥物在體內的高效遞送開辟出新的途徑。