釀酒葡萄品種對綠盲蝽抗性的篩選及其揮發物初步鑒定

武海燕，高素紅*，路常寬，李曉穎，崔 營

(1 河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北 秦皇島，066600；2 河北科技師范學院園藝科技學院)

隨著葡萄種植面積不斷擴大，葡萄產區常見的病蟲害都呈現出了逐年加重的趨勢[1～3]，其中又以綠盲蝽為主要害蟲之一。綠盲蝽不僅為害葡萄的生長發育，還會給果農帶來經濟損失[4～5]。葡萄新梢生長點被綠盲蝽刺吸后會很快干枯，導致葡萄停止生長；葡萄嫩葉受綠盲蝽為害后，葉面上會有許多刺吸點，形成不規則、皺縮的孔洞，影響葡萄植株的長勢；葡萄花蕾受綠盲蝽為害后，會影響葡萄的結果率，從而降低葡萄的產量；葡萄果粒受綠盲蝽為害后會影響葡萄的品質和出售[6]。因此加強葡萄種植過程中綠盲蝽的防控，已經成為果農的當務之急。

昆蟲在尋找寄主的過程中多靠嗅覺來辨別位置，通過植物釋放的揮發性物質來尋找合適的寄主植物，因此植物揮發物在昆蟲選擇寄主的過程中起著很大的作用。植物在適應病蟲害、干旱等不良的外界環境的過程中，也形成了自身特有的防御機制。其中組成防御機制主要包括植物形態上的防御、一些植物次生化合物以及植物始終釋放的能夠吸引昆蟲天敵的揮發性物質。該防御機制在植物全株表達，始終存在于植株中并發揮抗性作用[7]。同時，人們在對植物與昆蟲互相作用的研究中發現，部分植物揮發性物質對昆蟲有驅避、阻礙取食和誘集等作用[8，9]，不同品種植物對害蟲的趨避也存在差異[10，11]。目前釀酒葡萄對綠盲蝽的抗性篩選以及其揮發物的研究較少，因此筆者對綠盲蝽在葡萄園區的取食、產卵行為以及不同品種釀酒葡萄苗葉片釋放的揮發性物質進行研究，篩選對綠盲蝽具有抗性的釀酒葡萄品種，確定釀酒葡萄釋放的揮發性化合物，為綠盲蝽植物源誘抗劑的開發和應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2014年定植的赤霞珠、2015年定植的小味兒多和瑪瑟蘭、2016年定植的梅鹿輒、2017年定植的霞多麗、維歐尼、煙七三、小芒森、貴人香、威代爾、蛇龍珠、赤龍珠12個品種均由昌黎縣醉美酒莊提供，單臂籬架栽培；另一部分試驗材料由河北科技師范學院農學與生物科技學院實訓溫室提供，為2017年春季扦插的赤霞珠、瑪瑟蘭、小味兒多、梅鹿輒、霞多麗5種釀酒葡萄苗，各供試材料生長狀況良好。

1.2 試驗藥品與儀器

1.2.1藥品 色譜純二氯甲烷、50-80 mesh Porapak Q吸附劑(默克supelco)、活性炭。

1.2.2儀器 QC-1S氣體采樣儀(北京市科安勞保新技術公司生產)、2 mL棕色進樣瓶、BTH-10型活化儀(北京踏實德研儀器有限公司生產)、2 L氣體采樣袋(上海申源科學儀器有限公司生產)、Agilent Techologies 7890/5975C氣相色譜-串聯質譜聯用儀(美國Agilent公司生產)、移液槍、特氟龍管、立體顯微鏡等。

1.3 試驗方法

1.3.1綠盲蝽對不同品種釀酒葡萄葉片為害的調查方法 2019年7月26日、8月30日、9月16日、9月30日、10月15日，采用平行線取樣法，對昌黎縣醉美酒莊12種釀酒葡萄葉片的綠盲蝽為害情況進行調查。每個品種任選一個試驗小區，每個小區隨機選取10個枝條，調查每根枝條上所有葉片被綠盲蝽刺吸為害的情況。按照以下葉片受害分級標準進行釀酒葡萄葉片受害指數的計算。

0級：葡萄葉片正常

1級：葡萄葉片被害面積占葉片總面積的比例為 <25%

2級：葡萄葉片被害面積占葉片總面積的比例為26%～50%

3級：葡萄葉片被害面積占葉片總面積的比例為51%～75%

4級：葡萄葉片被害面積占葉片總面積的比例為 >75%

葉片受害指數：

受害指數=Σ(受害級別×相應的葉片數量)/(最大受害級別值×葉片總數)×100

參考陳瀚[12]的方法并修改，采用抗性值累計量化，綜合評價赤霞珠、瑪瑟蘭、霞多麗等供試釀酒葡萄品種對綠盲蝽的抗性指數(resistance index，RI)。將每次調查的葉片受害指數從大到小排列后，依次設為1～5的抗性值，即葉片受害指數最大的20%抗性值為1，葉片受害指數最小的20%抗性值為5。最后平均5次調查的抗性值，獲得各品種釀酒葡萄的綜合抗性指數，其中RI<2為高感(HS)，2≤RI<3為中感(MS)，3≤RI<4為中抗(MR)，RI≥4為高抗(HR)。

1.3.2不同品種釀酒葡萄上綠盲蝽越冬卵的調查方法 于2019年10月24日調查綠盲蝽越冬卵，從昌黎縣醉美酒莊采集各品種釀酒葡萄的冬芽，每種供試釀酒葡萄選取21個枝條，共計冬芽總數大于200，帶回實驗室內用解剖針剖開冬芽，在顯微鏡下觀察，記錄冬芽內綠盲蝽越冬卵的數量，并對不同品種釀酒葡萄的葉片受害指數與綠盲蝽越冬卵量進行相關性分析。

1.3.3不同品種釀酒葡萄葉片揮發性物質的收集方法 參考于惠林[13]、李茂業[14]和曹揚[15]的試驗方法，將2017年扦插的釀酒葡萄苗頂端的5片葉分別套上2 L的氣體采樣袋(采樣袋長24 cm，寬22 cm)，然后用大氣采樣儀循環采集揮發性氣體。田間采集時，氣體采樣袋其中的一個閥門用特氟龍管連接到大氣采樣儀進氣的一端，另一個閥門用特氟龍管連接到大氣采樣儀出氣的一端，進氣口的空氣通過活性炭過濾后進入大氣采樣袋，帶有植物揮發性氣體的空氣被吸附管中的吸附劑吸附后回流入大氣采樣儀，形成一個密閉的循環裝置。氣體流量為300 mL·min-1，連續收集4 h(每30 min平衡10 min)后帶回實驗室用色譜純二氯甲烷洗脫，并用氮氣濃縮至0.5 mL，然后置于-20 ℃條件下儲存備用，時間不超過3個月。

1.2.4釀酒葡萄葉片揮發性物質定性定量分析條件 色譜條件：色譜毛細管柱為HP-5MS色譜柱，載氣為氦氣，流速為1.0 mL·min-1。程序升溫方式：60 ℃保持2 min，然后以5 ℃·min-1的速度升到250 ℃，保持10 min，進樣量1 μL，溶劑延遲3 min。質譜條件：離子源為IE，離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV，質量掃描范圍為10～425 amu。

1.2.5釀酒葡萄葉片揮發物相對含量計算 測量各雜質峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各雜質峰面積及其之和占總峰面積的百分率。

2 結果與分析

2.1 不同品種釀酒葡萄葉片的受害情況

2019年7月26日至10月15日期間，綠盲蝽對不同品種釀酒葡萄的為害程度存在顯著差異。2019 年7月26日，綠盲蝽對煙七三的為害程度最重，葉片受害指數為30.605 3，對瑪瑟蘭的為害程度最輕，葉片受害指數為12.584 6；2019年8月30日，小味兒多葉片受害最重，葉片受害指數為26.365 6，赤龍珠葉片受害程度最輕，葉片受害指數為16.507 4；2019年9月16日，各釀酒葡萄總體受害程度較均勻，綠盲蝽對霞多麗的為害程度最高，其葉片受害指數為19.997 1，瑪瑟蘭受害最輕，葉片受害指數為13.361 0；2019年9月30日，綠盲蝽仍然對霞多麗的為害程度最重，對瑪瑟蘭的為害程度最輕，葉片受害指數分別為23.822 7和14.758 5；2019年10月15日，綠盲蝽對小味兒多的為害程度顯著高于其他釀酒葡萄品種，其葉片受害指數為27.068 9，瑪瑟蘭受害最輕，葉片受害指數為14.289 0(表1)。

表1 2019年7月26日～10月15日不同品種釀酒葡萄葉片的受害指數

2.2 不同品種釀酒葡萄對綠盲蝽的抗性水平

不同品種釀酒葡萄對綠盲蝽的抗性水平存在顯著差異。其中瑪瑟蘭的抗性指數大于4，對綠盲蝽的表現為高抗；赤霞珠、小芒森、貴人香、維歐尼、威代爾、赤龍珠6個釀酒葡萄品種為中抗品種，3≤抗性指數<4；霞多麗、煙七三、蛇龍珠3個釀酒葡萄品種為中感品種，2≤抗性指數<3；小味兒多、梅鹿輒2個釀酒葡萄品種的抗性指數<2，為高感品種，其中小味兒多對綠盲蝽的抗性指數最低(圖1)。

圖1 2019年7月26日～10月15日不同品種釀酒葡萄對綠盲蝽的抗性指數

2.3 不同品種釀酒葡萄上綠盲蝽越冬卵量的調查

2019年10月24日調查結果顯示，不同品種釀酒葡萄冬芽上綠盲蝽的越冬卵量存在顯著差異(表2)。在12種釀酒葡萄冬芽中均發現了綠盲蝽越冬卵，其中威代爾冬芽上的越冬卵量最多，單芽卵量為1.282 7 粒，其次是維歐尼冬芽上的綠盲蝽越冬卵量，單芽卵量為1.240 0粒；綠盲蝽越冬卵量最少的釀酒葡萄品種為赤龍珠，單芽卵量為0.269 7 粒。并采用IBM SPSS Statistics 21進行Pearson 相關性分析，發現2019年不同品種釀酒葡萄葉片的受害指數與綠盲蝽越冬卵量之間無相關性，其相關系數為-0.138。

表2 2019年10月不同品種釀酒葡萄冬芽上綠盲蝽的越冬卵量

2.4 5種釀酒葡萄揮發性物質定性分析

選取不同抗性葡萄品種，從葉片中共鑒定出53種物質，其中從瑪瑟蘭葉片中鑒定出 17種化合物；從赤霞珠葉片中鑒定出 18種化合物；從小味兒多葉片中一共鑒定出 12種化合物；從梅鹿輒葉片中鑒定出 20種化合物；而從霞多麗葉片中鑒定出 20種化合物(圖2，表3)。

圖2 5種釀酒葡萄葉片揮發性物質的總離子流圖

2.5 5種釀酒葡萄葉片揮發性物質定量分析

釀酒葡萄葉片中鑒定出的53種揮發性化合物按照化學結構可以分為多種種類。其中酯類最多，為 13種；其次是烴類 12 種；芳香類10種；酸6種；酮類4種；醇類3種；烯萜類、醛類、胺類各1種；其他2種。鑒定出的多種揮發性化合物中，4種釀酒葡萄共有的化合物有5種，包括鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、4’-乙苯乙酮、對異丙基苯丙酮、1,4-二乙酰苯；3種釀酒葡萄共有的化合物有鄰苯二甲酸二辛酯、4-乙基苯甲酸、2,2-二甲基庚烷、氯酸鈉化合物4種；2種不同釀酒葡萄共有的化合物包括3,4-二甲基苯甲酸4-叔丁基苯基酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、丁酸環己酯、2-乙基-4,5-二甲基苯酚、1,3,5-三乙基苯、1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、正十六酸、正十五烷、正庚烷、二十四烷11種，剩余揮發性化合物均為各釀酒葡萄所特有。而且，不同品種釀酒葡萄葉片釋放的同一類化合物的相對含量均存在一定的差異(表3)。

表3 5種釀酒葡萄葉片釋放的揮發物的種類及其各組分相對含量(質量分數) %

3 結論與討論

本次研究對綠盲蝽產卵選擇性和取食選擇性進行了調查與分析，明確了對綠盲蝽抗性較好的釀酒葡萄品種；對不同品種釀酒葡萄幼苗期葉片釋放的揮發物進行GC-MS檢測，明確了其種類和含量差異。

韋婉羚等[16]研究發現不同木薯品種上朱砂葉螨的為害程度不同；白宇等[17]依據平均受害指數對不同品種苜蓿的抗性進行評價，發現不同品種苜蓿對薊馬的抗性存在差異；楊宇暉等[18]對受綠盲蝽為害的棉花苗期、蕾期和鈴期葉片指數進行分析，得出不同棉花品種的抗蟲性存在顯著差異的結論。本文對昌黎縣醉美酒莊釀酒葡萄葉片的受害情況以及綠盲蝽越冬卵量進行調查分析，發現綠盲蝽對赤霞珠、威代爾、維歐尼、蛇龍珠、梅鹿輒、小芒森、貴人香、煙七三、霞多麗、瑪瑟蘭、小味兒多、赤龍珠12種釀酒葡萄葉片的為害情況存在顯著差異，其中瑪瑟蘭為高抗品種，赤霞珠、小芒森、貴人香、維歐尼、威代爾、赤龍珠為中抗品種，霞多麗、煙七三、蛇龍珠為中感品種，小味兒多、梅鹿輒為高感品種，說明不同植物品種對同一害蟲的抗性不同。對綠盲蝽越冬卵的數據進行分析，表明不同品種釀酒葡萄上的綠盲蝽越冬卵量差異顯著，同時由綠盲蝽越冬卵量與不同品種釀酒葡萄受害指數之間的Pearson 相關系數可知，綠盲蝽在不同釀酒葡萄品種上的為害情況與其越冬卵量存在顯著差異，表明不同釀酒葡萄對綠盲蝽取食和產卵行為的影響不同。

張立娟[19]研究發現寄主植物釋放的揮發物種類和含量會影響綠盲蝽對寄主的選擇，同時由植物的組成防御機制推測，不同品種釀酒葡萄抗性不同的原因可能是植物本身產生的次生代謝物質不同，從而影響了綠盲蝽對寄主的選擇。因此本文選擇瑪瑟蘭、赤霞珠、霞多麗、梅鹿輒和小味兒多5種釀酒葡萄苗，對其揮發物進行比較與分析。結果表明不同抗性的釀酒葡萄，其釋放的揮發物在成分及含量上都存在差異。部分揮發性化合物都曾進行過研究分析，例如鄰苯二甲酸二丁酯在濃度為0.1 μL·mL-1時，對黃曲條跳甲雌蟲具有趨避作用[20]；稀釋 100 倍的鄰苯二甲酸二丁酯，對蓮草直胸跳甲成蟲表現出顯著的忌避作用，而原藥和稀釋 1000 倍的濃度卻無顯著影響[21]；鄰苯二甲酸二甲酯在濃度為1.00 mol·L-1時對日本雙棘長蠹成蟲具有驅避作用，但在濃度為0.01 mol·L-1時即不具有趨避性也不具有引誘性[22]；棕櫚酸甲酯在稀釋濃度為10-2或10-4時對普通大薊馬具極顯著驅避作用，在稀釋濃度為10-6時對普通大薊馬即沒有驅避作用也沒有引誘作用[23]；二十四烷在濃度為5×10-3g·mL-1時對亞洲玉米螟初孵幼蟲的取食行為具有趨避作用[24]。已經確定這些物質在一定濃度下對害蟲具有趨避性，因此推測其對綠盲蝽的行為反應可能也具有一定的影響，但具體為趨避性還是引誘性需要進一步分析，后續會進行相關研究。釀酒葡萄對綠盲蝽的抗性受多種因素的影響，如植物的形態防御、植物的次生化合物以及植物釋放的揮發性物質等組成防御機制，一直存在于葡萄植株中并對害蟲起到抗性作用。本研究表明越冬卵量不是影響綠盲蝽取食行為的主要因素，更可能受一些揮發性物質的影響，具體的行為反應有待進一步深入研究。