結直腸癌患者血清microRNA-335、microRNA-497表達與臨床病理特征及預后的關系*

聶向榮，武劍磊，武永慶

[邯鄲市中心醫院1.普外三科，2.邯鄲市中心醫院急診外科，河北邯鄲056001；3.武安市第一人民醫院骨科，河北武安056399]

2018年國際結直腸癌新發病例約為110萬人，占惡性腫瘤新發病例的6.1%，而死亡人數約為55 萬人，占惡性腫瘤死亡人數的5.8%，發生率和病死率分別排在惡性腫瘤的第4 位和第5 位，對人們的生命健康造成嚴重威脅[1]。目前對結直腸癌的發病過程仍然缺乏了解，已有研究報道在結直腸癌發生、發展過程中大量microRNA（miRNA）的表達存在異常[2]。miRNA 是一類長度在20～25 nt 的單鏈RNA 分子，不編碼多肽和蛋白質，但是在細胞分裂、分化、細胞代謝、細胞物質運輸等過程中均起到一定的調節作用[3]。其中microRNA-335（miR-335）與腫瘤的發生、發展密切相關，是一種抑癌基因，在肝癌和肺癌中低表達，并且能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[4]。microRNA-497（miR-497）同樣是一種抑癌基因，在肝癌和喉鱗狀細胞癌中低表達，并且miR-497低表達與腫瘤患者的不良預后密切相關[5-6]。本研究通過檢測血清miR-335、miR-497 表達水平，探討其表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征和預后的關系。現報道結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月—2014年9月于邯鄲市中心醫院診治的結直腸癌患者99 例作為結直腸癌組。其中，男性59 例，女性40 例；年齡42～75 歲，平均（58.67±13.96）歲；腫瘤直徑＜5 cm 的52 例，腫瘤直徑≥5 cm 的47 例。32 例腫瘤位于左半結腸，31 例位于右半結腸，36 例位于直腸。浸潤深度T1患者11 例，T2患者16 例，T3患者39 例，T4患者33 例。TNM 分期Ⅰ期患者41 例，Ⅱ期患者27 例，Ⅲ期患者31 例。腫瘤低分化患者17 例，腫瘤中分化患者51例，腫瘤高分化患者31例。有脈管浸潤25例，有神經浸潤9例。淋巴結轉移患者37 例，無淋巴結轉移患者62 例。選擇同期在該院體檢的99 例健康者作為健康組。其中，男性53例，女性46例。年齡40～71歲，平均（54.96±12.87）歲。納入標準：①患者經病理學診斷確診為結直腸癌；②入院前6 個月內無抗炎藥物治療史；③無放化療治療史；④患者適宜進行手術治療。排除標準：①合并其他腫瘤；②存在全身性感染性疾病、系統性疾病和自身免疫性疾病；③臨床病理資料不完整；④入院前3 個月內有外科手術史。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象簽署同意書。

1.2 實驗試劑及儀器

miRNA 分離試劑盒（商品編號：QA1290）、cDNA合成試劑盒（商品編號：QA2317）、mirVana?qRTPCR miRNA 檢測試劑盒（商品編號：QA1541）均購自德國Qiagen 有限公司，引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。臺式高速離心機（型號：5810）購自美國Eppendorf 科學儀器有限公司，熒光定量PCR 儀（型號：VIIA7）購自美國ABI 科技有限公司。

1.3 血清miR-335、miR-497表達水平檢測

1.3.1 血清總RNA提取采集入組人員空腹靜脈血5 ml（健康組體檢時及結直腸癌組入院后），室溫3 000 r/min 離心20 min，半徑10 cm，取上清液于另一干凈離心管中，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用miRNA 分離試劑盒對血清中的總RNA 進行提取，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 miRNA 逆轉錄使用cDNA 合成試劑盒對miRNA 進行逆轉錄，逆轉錄體系總體積為20 μl，包括：總RNA 1 μl，miRNA-Script-緩沖液4 μl，逆轉錄引物Mix 2 μl，蒸餾水13 μl。逆轉錄條件：37℃逆轉錄1 h；98℃酶滅火10 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測使用mirVana?qRT-PCR miRNA 檢測試劑盒對逆轉錄得到的cDNA 進行定量檢測，反應體系總體積20 μl，包括逆轉錄產物2 μl，水7 μl，SYBR Mix 10 μl，PCR 正反向引物各0.5 μl。反應條件：95℃變性20 s，53℃退火30 s,72℃延伸30 s，循環35 次。miR-335正向引物：5'-TAAAGGGGGTTTTGTTTATT-3'，反向引物：5'-CCCACAAACTACCCACAAAC-3'。miR-497正向引物：5'-GTCCTATCCAGTGCAGGGT-3'，反向引物：5'-CCAGGTATTCCCACTCGGATAC-3'。以U6基因作為內參，U6引物序列，正向：5'-CGCTTCGG CAGCACATATAC-3'，反向：5'-AAATATGGAACGCT TCACGA-3'。根據2-△△Ct法計算miR-335、miR-497的相對表達量，-△△CtmiR-335=△CtmiR-335-△CtU6，-△△CtmiR-497=△CtmiR-497-△CtU6。以健康組和結直腸癌組血清miR-335、miR-497 相對表達量的均值作為相應的分組依據，其中，血清miR-335 相對表達量≥21.26 為高表達，＜21.26 為低表達。血清miR-497相對表達量≥18.06為高表達，＜18.06為低表達。

1.4 隨訪

隨訪方式以電話隨訪和門診復查為主，當患者出現復發或死亡時隨訪結束。患者的生存時間為治療結束日至末次隨訪日或治療結束日至患者死亡日。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；計數資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-335、miR-497相對表達量的比較

兩組血清miR-335 和miR-497 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），結直腸癌組低于健康組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-335、miR-497相對表達量比較（n=99，±s）

表1 兩組血清miR-335、miR-497相對表達量比較（n=99，±s）

組別健康組結直腸癌組t 值P 值miR-335 29.73±9.59 12.79±3.55 16.483 0.000 miR-497 26.16±8.44 9.95±2.76 18.163 0.000

2.2 結直腸癌患者不同因素血清miR-335 和miR-497 相對表達量的比較

不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、脈管浸潤、神經浸潤、淋巴結轉移患者的血清miR-335 相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、分化程度的患者血清miR-335相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），TNM 分期Ⅰ、Ⅱ和高分化患者血清miR-335 相對表達量高于TNM分期Ⅲ和低分化患者。

不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、脈管浸潤、神經浸潤、淋巴結轉移患者的血清miR-497 相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、淋巴結轉移患者血清miR-497相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），浸潤深度T1、T2，TNM分期Ⅰ、Ⅱ，及無淋巴結轉移患者血清miR-497 相對表達量高于浸潤深度T3、T4，TNM分期Ⅲ，及有淋巴結轉移患者。見表2。

表2 結直腸癌患者不同因素間血清miR-335和miR-497表達水平的比較 （±s）

表2 結直腸癌患者不同因素間血清miR-335和miR-497表達水平的比較 （±s）

臨床病理特征年齡＜60歲≥60歲性別miR-335 t/F 值P 值miR-497 t/F 值P 值13.05±4.21 12.29±3.41 1.165 0.247 10.21±3.29 9.45±2.63 0.908 0.366男女12.87±4.15 12.67±3.52 0.273 0.786 10.02±3.23 9.85±2.74 0.250 0.803

續表2

2.3 血清miR-335、miR-497表達水平與結直腸癌患者預后的關系

血清miR-335 高表達組患者的中位生存時間為55 個月，5年生存率為67.24%（39/58）。血清miR-335低表達組患者的中位生存時間41個月，5年生存率為48.78%（20/41）。兩組比較，差異有統計學意義（χ2=5.594，P=0.018），血清miR-335 高表達組患者5年生存率高于低表達組患者。血清miR-49 高表達組患者的中位生存時間為55 個月，5年生存率為65.45%（36/55）。血清miR-497 低表達組患者的中位生存時間42個月，5年生存率為52.27%（23/44）。兩組比較，差異有統計學意義（χ2=4.046，P=0.044），血清miR-497 高表達組患者5年生存率高于低表達組患者。見圖1。

圖1 血清miR-335、miR-497高低表達組生存曲線圖

3 討論

miRNA 能夠與基因的信使RNA（mRNA）非編碼區結合，促進mRNA 的降解，從而調控基因的表達水平[7]。一種miRNA 能夠與多種基因的mRNA 結合，從而調控多種基因的表達，并且miRNA 之間也存在相互調控機制，因此在細胞中存在復雜的miRNA 調控途徑[8]。通過RNA-seq和基因芯片等高通量技術發現在結直腸癌發生、發展過程中miRNA 途徑發生紊亂，部分miRNA 的表達呈現顯著上調和顯著下調趨勢，導致細胞的惡性增殖和腫瘤發生[9]。例如XU等[10]通過RNA-seq 技術對結直腸癌細胞進行RNA 組學高通量測序，發現眾多miRNA 表達異常，并且存在十分復雜的miRNA-mRNA 調控途徑。對結直腸癌中miRNA 的表達情況及其與預后的關系進行分析，對制訂針對性干預措施以提高和改善患者的預后和生存具有重要意義。

miR-335 能夠抑制腫瘤的發生、發展，在胃癌和甲狀腺癌中miR-335 表達水平均下調[11]。首先，miR-335 能夠抑制促癌基因的表達，繼而抑制腫瘤細胞的惡性增殖，從而發揮抑癌基因的作用。如LIU等[12]的研究發現在胃癌中miR-335能夠抑制生存素促癌基因的表達，進而促進胃癌細胞增殖。其次，miR-335能夠抑制腫瘤增殖相關信號通路的活化，進而抑制腫瘤細胞的增殖。WANG等[13]發現在膀胱癌中細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）信號通路中ERK1和ERK2基因均是miR-335 的直接作用靶點，miR-335 能夠下調ERK1和ERK2基因表達，進而抑制ERK 信號通路的活化，從而抑制膀胱癌細胞增殖。本研究發現在結直腸癌患者中血清miR-335表達水平下降，表明miR-335可能起到抑癌基因的作用。進一步研究發現miR-335表達水平在TNM 分期較高、分化程度較低的結直腸癌患者中降低，表明miR-335 低表達可能與結直腸癌的惡性增殖和低分化密切相關。Kaplan-Meier 生存曲線結果顯示miR-335 低表達患者的總生存率下降，表明miR-335 表達水平與結直腸癌患者的預后相關，并且miR-335 低表達結直腸癌患者預后較差。推測其原因，可能是由于人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）、ERK和多聚ADP 核糖轉移酶（PARP1）等基因均是miR-335 的作用靶點，而PTEN、ERK和PARP1是較強的促癌基因，能夠有效促進腫瘤細胞增殖，同時降低腫瘤的分化程度，并且三者在MAPK、ERK 和凋亡相關信號通路中均起到關鍵作用，與腫瘤的惡性程度存在明顯的正相關性，miR-335 抑制PTEN、ERK和PARP1表達能夠有效降低結直腸癌的惡性程度，從而抑制結直腸癌發生發展[14-15]。

miR-497 是與腫瘤發病密切相關的miRNA，在骨肉瘤和乳腺癌中表達缺失，能夠抑制腫瘤的發生、發展，并且miR-497 低表達與骨肉瘤和乳腺癌患者的不良預后密切相關[16]。miR-497 對腫瘤細胞的作用機制主要是通過調節癌基因表達完成的，miR-497 能夠與癌基因mRNA 的非編碼區結合，導致mRNA 的穩定性下降并促進核糖核酸酶對mRNA的降解，從而導致癌基因表達水平下降。例如CHENG 等[17]發現在肝癌細胞中胰島素樣生長因子受體1（IGF1R）癌基因是miR-497 的直接作用靶點，miR-497 能夠下調IGF1R 癌基因表達，進而抑制肝癌發生發展。同時miR-497 也可與lncRNA 結合并介導lncRNA 降解，形成lncRNA-miRNA-mRNA 調控途徑，lncRNA 與miR-497 的結合能夠解除miR-497 對癌基因的抑制作用，從而促進腫瘤發生、發展。例如MA 等[18]研究發現在胃癌中miR-497 能夠與長鏈非編碼RNA X 染色體失活特異轉錄本（lnc RNA XIST）結合，從而解除miR-497 對人結腸癌轉移關聯基因1（MACC1）的抑制作用，進而促進胃癌細胞增殖和轉移。其次，miR-497 能夠同時抑制信號通路中多個基因的表達，進而抑制腫瘤增殖和轉移相關信號通路的活化，導致腫瘤發生、發展受到抑制。例如TAO 等[19]發現在宮頸癌細胞中miR-497 能夠負調控絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號通路的活化，進而促進宮頸癌細胞凋亡并抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移。本研究結果發現，在結直腸癌患者中血清miR-497 表達水平下降，表明miR-497 表達水平可能與結直腸癌的發生、發展密切相關，并且在結直腸癌中可能起到抑癌基因的作用。進一步研究發現miR-497 表達水平在浸潤深度較深、TNM分期較高、有淋巴結轉移的結直腸癌患者中降低，表明miR-497 低表達可能與結直腸癌的侵襲和轉移密切相關。Kaplan-Meier 生存曲線結果顯示miR-497低表達患者的總生存率下降，表明miR-497 表達水平與結直腸癌患者的預后相關，并且miR-497 低表達結直腸癌患者預后較差。推測其原因，可能是由于miR-497 作為抑癌基因在腫瘤當中具有普遍性，miR-497 在結直腸癌中低表達導致miR-497 對MAPK信號通路的抑制作用下降，使得MAPK 信號通路異常活化，而MAPK 信號通路參與腫瘤侵襲、轉移等過程，因此結直腸癌miR-497 表達下降會促進結直腸癌細胞侵襲和轉移，導致結直腸癌細胞在患者體內擴散并形成相應轉移灶，導致患者出現臟器衰竭而死亡[20]。

綜上所述，血清miR-335、miR-497 在結直腸癌患者中的表達水平下降，且miR-497 表達水平與結直腸癌的侵襲和轉移有關，而miR-335 表達水平與結直腸癌的惡性增殖和分化程度有關，兩者的低表達與結直腸癌患者的不良生存預后有關。鑒于miR-335、miR-497 在多種腫瘤中均低表達，是否能作為結直腸癌的標志物還需要進一步深入研究，并且對兩者在結直腸癌發生、發展過程中的分子機制仍需要進一步深入探究。