RNF2在結直腸癌中的表達及其對結直腸癌細胞生物學行為的影響*

賈楠，宋哲，陳寶勝，程進生

（1.滄州市中心醫(yī)院普外二科，河北滄州061001；2.獻縣人民醫(yī)院，河北滄州062250）

結直腸癌已成為我國第3 大常見惡性腫瘤[1]。年齡＞50 歲、有結直腸癌家族史、相關消化系統(tǒng)病史及不健康的生活飲食習慣均是結直腸癌發(fā)生的高危因素。近年對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為研究較多，大量報道顯示結直腸癌生物學行為可能影響患者抑癌基因、癌基因、血清腫瘤相關標志物及細胞因子，從而加重疾病發(fā)展[2-3]。研究表明[4]，環(huán)指蛋白2（cyclic finger protein 2,RNF2）具有E3 連接酶活性，對血管正常發(fā)育、生長、重塑及細胞增殖、遷移、侵襲有顯著影響。另RNF2 還可負反饋影響血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF） 表達，對內(nèi)皮細胞增殖及血管生成產(chǎn)生抑制作用。國內(nèi)已有研究證實RNF2 在食管癌、乳腺癌等腫瘤中均呈異常表達，且與多種疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關[5-6]。同時，也有多項研究對結直腸癌組織中相關因子表達進行報道，并指出其可能參與癌細胞生物學過程[7-8]。以上均提示RNF2 在癌細胞侵襲、遷移、血管生成等方面具有顯著影響。但結直腸癌組織中RNF 的表達及其臨床意義尚無相關報道，因此本研究就此展開討論，以期為結直腸癌治療提供新思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月—2019年6月滄州市中心醫(yī)院收治并確診的62 例結直腸癌患者的癌組織及距癌旁＞2 cm 正常黏膜組織。其中，男性40例，女性22例；年齡40～79歲，中位年齡65歲，≥65歲38例，＜65歲24 例；發(fā)病部位左39 例，右23 例；乳頭狀腺癌8 例，管狀腺癌40 例，其他腺癌14 例；高分化11 例，中分化35 例，低分化16 例；Dukes 分期A、B 期39 例，C、D 期23 例；無淋巴結轉(zhuǎn)移38 例，有淋巴結轉(zhuǎn)移24 例。納入標準：①經(jīng)病理學檢查確診為結直腸癌且均為腺癌；②入院前未接受放、化療；③臨床資料完整，相關檢查完善；④入院前無重大出血史；⑤肝、腎、心功能均正常。排除標準：①預計生存期＜2 個月；②對治療不耐受；③血標本采集困難或標本不正確；④過敏體質(zhì)；⑤合并精神疾病或語言功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色

取結直腸癌組織及癌旁正常組織，10%甲醛溶液（上海遠慕生物科技有限公司）固定，經(jīng)梯度濃度酒精（上海譜振生物科技有限公司）脫水，二甲苯（北京三藥科技開發(fā)公司） 透明；采用Arcadia 組織包埋機（浙江徠卡生物科技有限公司）將組織用石蠟（上海依赫生物科技有限公司）包埋成塊，連續(xù)切成4 μm 厚切片，依次采用二甲苯、沸騰的檸檬酸鈉緩沖液（長沙達爾鋒生物科技有限公司）、3%過氧化氫（上海澤葉生物科技有限公司）進行脫蠟、抗原修復、梯度酒精水化、PBS 漂洗、內(nèi)源性過氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人RNF2 多克隆抗體（Sino Biological，濃度1∶100）4℃孵育過夜，PBS 漂洗3 次后滴加通用型二抗（廈門研科生物技術有限公司）37℃孵育30 min；再次漂洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（武漢純度生物科技有限公司），37℃孵育20 min；PBS漂洗，經(jīng)DAB（上海恒斐生物科技有限公司）顯色、蘇木精（上海源葉生物科技有限公司）復染，脫水，透明，封片，Olympus CX31 光學顯微鏡（廣州科適特科學儀器有限公司）下觀察結直腸癌組織和癌旁正常組織中RNF2 表達。由5年以上臨床經(jīng)驗的專科醫(yī)師在不清楚患者資料情況下觀察和判定結果：著色細胞染色強弱：0 分無色，1 分黃色，2 分棕黃色，3 分棕褐色；陽性細胞所占視野百分比：0 分為陽性細胞率≤5%，1 分為陽性細胞率＞5%～25%，2分為陽性細胞率＞25%～50%，3分為陽性細胞率＞50%。兩項評分之積為最終得分：陰性0～1分，弱陽性2分，陽性3～4分，強陽性5～6分。最終得分≤2 分陰性表達；最終得分＞2 分陽性表達。

1.3 細胞增殖、遷移及侵襲實驗

1.3.1 CCK-8 法依次準備結直腸癌細胞系HCT116（上海酶研生物科技有限公司），陰性對照組病毒原液（HCT116-control）與RNF2 過表達的病毒原液（HCT116-RNF2）作為3 個組，傳代培養(yǎng)各組細胞，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞制備成單細胞懸液，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中（2×103個/孔）；待細胞貼壁后，每孔加入10 μl CCK-8 試劑（上海炎熙生物科技有限公司），37℃孵育0 h、12 h、14 h、36 h、48 h 后在HBS-1096A 酶標儀（美國Bio Tek公司）540 nm 處檢測各孔光密度（OD）值。

1.3.2 Transwell 細胞遷移、侵襲實驗細胞劃痕實驗：取轉(zhuǎn)染后細胞使各組細胞密度約為90%，用200 μl 無菌槍頭對孔板培養(yǎng)細胞進行劃痕處理，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入無血清培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，Image J 軟件計算每個視野的劃痕面積，細胞遷移率=（T0時面積-T24時面積）/T0時面積*100%。Transwell：調(diào)整細胞濃度為5× 105個/ml，向上室加入細胞懸液200 μl，向下室加入700 μl 培養(yǎng)基（含有20% FBS），48 h后將Transwell 小室進行PBS 清洗，置于甲醛中固定15 min，0.2%結晶紫（北京百奧萊博科技有限公司）染色20 min，隨機選取5 個視野拍照并進行技術統(tǒng)計；將Transwell 小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，按上述步驟操作，顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁正常組織中RNF2的表達

RNF2 主要定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒（見圖1）；結直腸癌組織中RNF2 陽性表達率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見表1。

圖1 免疫組織化學染色切片圖 （SP×200）

表1 結直腸癌組織和癌旁正常組織RNF2陽性表達率比較 （n=62）

2.2 RNF2 表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

不同性別、部位的直腸癌患者的RNF2 表達陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學類型、分化程度、Dukes 分期、淋巴結轉(zhuǎn)移的結直腸癌患者的RNF2 表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 結直腸癌患者不同因素間RNF2表達陽性率的比較例（%）

2.3 過表達RNF2對HCT-116增殖的影響

各組過表達RNF2 后12 h、24 h、36 h、48 h 后HCT-116 細胞OD 值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OD 值有差異（F=3 203.034，P=0.000）；②各組OD 值有差異（F=476.864，P=0.000）；③各組OD 值變化趨勢有差異（F=4 247.089，P=0.000）。見表3。

表3 不同組別與不同時間的細胞OD值比較 （±s）

表3 不同組別與不同時間的細胞OD值比較 （±s）

組別0 h 12 h 24 h 36 h 48 h HCT116組HCT116-control組HCT116-RNF2組0.33±0.04 0.30±0.04 0.31±0.02 0.49±0.06 0.31±0.03 0.32±0.05 0.48±0.14 0.30±0.06 0.30±0.05 0.77±0.12 0.32±0.05 0.31±0.04 0.96±0.13 0.34±0.04 0.33±0.05

2.4 過表達RNF2對HCT-116遷移的影響

HCT116、HCT116-control、HCT116-RNF2 組HCT116 細胞劃痕面積，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=35.400，P=0.000）；兩兩比較，HCT116-RNF2 組細胞劃痕面積大于HCT116-control組、HCT116 組（P＜0.05）。見圖2 和表4。

圖2 細胞劃痕實驗

表4 各組HCT116細胞遷移率比較（n=10，個，±s）

表4 各組HCT116細胞遷移率比較（n=10，個，±s）

注：①與HCT116 組比較，P ＜0.05；②與HCT116-control 組比較，P ＜0.05。

細胞遷移率6.65±3.77 45.32±4.05 61.17±4.22①②組別HCT116組HCT116-control組HCT116-RNF2組

2.5 過表達RNF2對HCT116侵襲的影響

HCT116 組、HCT116-control 組、HCT116-RNF2組穿過小室膜的細胞數(shù)分別為（0.84±0.32）、（0.71±0.27）和（1.32±0.39），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.462，P=0.001）；兩兩比較，HCT116-RNF2 組穿過小室膜的細胞數(shù)多于HCT116-control組、HCT116組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 過表達RNF2對HCT116侵襲的影響

3 討論

近年對腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為的報道較多，在結直腸癌組織中癌細胞的侵襲可經(jīng)病灶部位蔓延至淋巴管，快速擴散、增殖至全身[9]。既往多認為胚胎發(fā)育及干細胞自我更新與該病理特性有關[10]，而目前關于RNF2 與腫瘤間的關系報道較多，學者提出RNF2 與腫瘤相關標志物、血管纖維化及基因轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄過程密切相關[11-12]。

劉建敏等[13]早已指出RNF2 為腫瘤相關敏感因子，通過下調(diào)RNF2 表達，發(fā)現(xiàn)喉癌細胞生長受到顯著抑制。該實驗結果對本研究有一定參考價值，考慮可通過敲除或下調(diào)RNF2基因判斷其對生物性特性的影響。本文探究結直腸癌組織RNF2 表達與其生物學特性的相關性，目前尚未見此類相關報道，具有一定創(chuàng)新性。本研究顯示結直腸癌組織中RNF2 表達水平高于癌旁正常組織，且年齡≥65歲、高、中分化程度，Dulses 分期C、D 期、有淋巴結轉(zhuǎn)移的結直腸癌患者RNF2 表達陽性率高，符合既往研究中指出的RNF2 在腫瘤組織中呈高表達特點。結直腸上皮正常細胞發(fā)生突變后，可通過刺激肽類血管生成因子表達而產(chǎn)生大量RNF2 蛋白抑制血管形成、重塑及機體正常組織器官功能維護。目前已發(fā)現(xiàn)的18 個多梳蛋白家族（PcGs）成員中RNF2 為其核心成員之一，與PcGs 一樣可通過表觀遺傳學事件抑制靶基因活性而參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展。RNF2 通過催化組蛋白賴氨酸單泛素化造成基因沉默和抑制轉(zhuǎn)錄過程，從而發(fā)揮促癌作用[14]。另GERGELY 等[15]上調(diào)大鼠RNF2 基因后其內(nèi)皮細胞形態(tài)異常，血管穩(wěn)定性遭到破壞，且癌細胞增殖和侵襲能力加強。YANG 等[16]的動物模型實驗顯示，食管癌鼠敲除RNF2基因后小鼠血管、血管腔變小，毛細血管減少，內(nèi)皮細胞與成纖維細胞的聯(lián)系異常。以上實驗均說明RNF2 對血管生成、干細胞增殖分化和干細胞自我更新有抑制作用，且可促進癌細胞發(fā)生和發(fā)展。同時考慮RNF2過表達可導致細胞對細胞外基質(zhì)的黏附減弱，從而提高腫瘤增殖、侵襲能力。為進一步探究RNF2過表達對結直腸癌細胞遷移、增殖、侵襲等生物學行為的影響，本研究利用過表達慢病毒轉(zhuǎn)染HCT-116 細胞構建過表達RNF2 的HCT-116 細胞系并進行細胞增殖、遷移及侵襲實驗，結果發(fā)現(xiàn)過表達RNF2 后，結直腸癌細胞體外遷移、增殖、侵襲能力明顯提高。有研究認為RNF2 可能通過FBXW7基因位點促進結結直腸癌細胞生物學行為的發(fā)生[17]。

綜上所述，過表達的RNF2 可影響結直腸癌細胞生物學行為，可為結直腸癌治療提供新的治療靶點。但由于本研究樣本量少、隨訪時間短，關于RNF2 是否可能成為結直腸癌治療靶點需在臨床研究中進一步探討。