供體牛外周血AMH濃度對荷斯坦青年奶牛體內胚胎生產效率的影響

李樹靜，馮春濤，胡智輝，朱化彬，余文莉* ，趙善江*

(1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050299; 2. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193)

母牛發情周期中卵巢卵泡發育數量及質量直接決定著其繁殖性能[1-2]，正常生理狀態下，卵泡發育、成熟和排卵不僅受下丘腦-垂體-卵巢生殖軸的激素調節[3-5]，而且還受抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)等卵巢自身分泌激素的調節[6]。AMH是由卵巢早期有腔卵泡的顆粒細胞合成分泌的一種糖蛋白激素，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的一員，AMH合成后釋放進入卵泡液和外周血，可以通過放射免疫或者酶聯免疫吸附法(ELISA)等方法從血樣中檢測出來[6]。多項研究發現，AMH與卵巢儲備和發育潛能關系密切，外周血中AMH濃度可以較為準確地反映卵巢上發育的有腔卵泡數量(antral follicle count, AFC)和質量[6-9]，并對動物超數排卵(超排)的效果有直接影響[6, 10-11]。

AMH水平下降與多個物種雌性動物的生殖力下降相關，因而，血液中AMH濃度高低可作為母牛繁殖性能高低的內分泌標記物[12-13]。目前，在人的輔助生殖中，AMH已經比較廣泛地用于預測女性卵巢儲備和激素處理下卵巢產生可用卵子的可能性。同樣，牛AMH水平也可以用于選擇繁殖力或者人工授精受胎率高的奶牛或肉牛，作為超數排卵-胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)篩選供體牛的一個高效標志分子，可以幫助選擇能夠提供更多可移植胚胎的供體母牛，以增加體內胚胎生產的效率。

當前，MOET技術已經在全球商業化應用，成為牛新品種培育和快速擴繁的重要技術手段[14-15]。然而在過去的30年里，通過超數排卵供體牛生產的可用胚胎數量一直沒有得到顯著的提高[16-17]，而這其中不同供體牛卵巢對外源促性腺激素處理的反應不穩定可能是導致體內胚胎生產效率低的重要原因之一[18]。因此，近年來，從事胚胎生產的研究人員一直在致力于尋找可預測供體母牛超排反應效果、胚胎生產數量的分子標記物，以用于預測和篩選超排反應良好的供體牛，從而獲得更多的可用胚胎[19-21]。研究表明，供體牛血清中AMH濃度與超排后獲得胚胎數量相關性高[22-24]。但是國內關于供體牛外周血AMH濃度與體內胚胎生產效率的研究較少，尤其是對超排處理過程不同時間點供體牛外周血AMH濃度與供體牛MOET獲得胚胎數量相關性的研究少，僅見薛建華等[25]研究的供體牛血液中AMH濃度對荷斯坦供體牛可獲得胚胎數的影響，畢江華等[26]等研究的重復超排過程中血液AMH濃度對超排效果的影響，但是上述研究的研究內容較為單一，且AMH采樣時間點單一，部分研究的試驗動物頭數也較少。

本試驗分別采集CIDR埋置、人工授精和胚胎回收3個時間點的外周血，研究體內胚胎實際生產過程中不同時間點供體牛外周血AMH濃度與體內胚胎生產效率的相關性，以期為供體牛的高效篩選提供一定的應用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

供體母牛為營養狀況良好、發情周期正常、14～16月齡的96頭荷斯坦青年牛，試驗地點為石家莊天泉良種奶牛有限公司，時間為2019年7～9月。

1.2 試驗試劑

促卵泡激素(FSH，Folltropin-V， 稀釋后20 mL·瓶-1， 含NIH-FSH-P1 20 mg· mL-1，Bioniche公司生產)、孕酮陰道栓 (CIDR，1.56 g孕酮·支-1，Vetoquinol公司生產)、氯前列腺稀醇(PG，0.322 mg·mL-1，齊魯動物保健品公司生產)，保存液、沖胚液均由Bioniche公司生產；AMH檢測試劑盒(Beckman)。

1.3 試驗設計

根據供體牛的選擇標準，挑選符合條件的健康供體母牛。分別采集供體牛胚胎生產過程中CIDR埋置、人工輸精以及胚胎回收當天的外周血，檢測AMH濃度的同時測量記錄供體牛體重，分別將不同時期的AMH濃度和體重按照高(分布最高的25%)、中等(分布中間的25%～75%)、低(分布最低的25%)分為3組。

1.3.1 超數排卵 供體母牛超排處理時間和操作見圖1。試驗采用連續4 d 遞減注射FSH方法超排處理供體牛，1瓶FSH(400 mg)用20 mL無菌超純水稀釋為20 mg· mL-1。具體操作：供體牛埋置CIDR的同時肌肉注射10 mL 維生素ADE(埋植當天計為第0天)，埋置CIDR后第5 天開始超數排卵處理，每天07:00、19:00 分2次肌肉注射FSH(第5天：3 mL·頭-1×2次；第6 天：2 mL·頭-1×2次；第7天：1 mL·頭-1×2次；第8 天：0.5 mL·頭-1×2次)； 第7天兩次肌肉注射FSH同時注射兩次PG(0.6 mg·頭-1)并撤出CIDR；第9天全天人工觀察發情，站立接受爬跨后10～12 h進行人工授精(未發情牛同樣參加配種)，間隔10～12 h后進行第二次人工授精，每天早、晚兩次觀察供體母牛自然發情情況并記錄。第16天采用非手術方法采集胚胎。

圖1 體內胚胎生產流程示意圖

1.3.2 胚胎采集與質量鑒定 對供體牛進行利多卡因硬膜外麻醉后，高錳酸鉀水消毒外陰，紙巾擦拭后酒精消毒并用生理鹽水沖洗干凈。用15號采卵管(w?rrlein 15)采集胚胎，兩側子宮角共用400 mL PBS液回收胚胎。體式顯微鏡下收集胚胎并根據形態學鑒定胚胎質量，分為可用胚胎(A、B級)和不可用胚胎(退化胚、未受精胚)。

1.3.3 血液采集及處理 埋植CIDR(第0 天)當天上午、第一次人工授精時和胚胎回收當天各采集供體血液5 mL(促凝管，河北鑫樂科技有限公司)。血樣室溫下靜置2 h后2 500 r·min-1離心10 min，收取血清并按試驗編號分裝標記，于-20 ℃冰箱保存。ELISA檢測血清中AMH濃度。

1.3.4 測定指標和數據篩選 測定不同試驗組間AMH濃度、回收胚胎數、可用胚胎數、A級優質胚胎數、不可用胚胎數、退化胚胎數、未受精卵母細胞數等指標。所有數據按照“平均數±3倍標準差”的標準進行剔除。經過數據篩選，符合上述條件的供體牛為92頭。

1.4 統計分析

試驗數據采用“平均值±標準誤”表示，各組數據應用SAS 9.2軟件分別對不同供體類型、超排次數、FSH劑量和同期發情處理方法進行單因素方差分析及多重比較。P<0.05 表明組間差異顯著。

2 結 果

2.1 外周血AMH濃度分析

結果表明，體內胚胎生產過程中的3個時間點(CIDR埋置、人工輸精和胚胎回收)外周血AMH濃度均為正態分布，從CIDR埋置到胚胎回收，其濃度呈明顯減少的趨勢(圖2)。CIDR埋置時平均AMH濃度為(113.51±2.66) ng·L-1，最大值為224.10 ng·L-1，最小值72.12 ng·L-1，上四分位數為126.07 ng·L-1，下四分位數為96.66 ng·L-1。人工輸精時平均AMH濃度為(86.27±3.74)ng·L-1，最大值為225.54 ng·L-1，最小值32.98 ng·L-1，上四分位數為112.06 ng·L-1，下四分位數為55.18 ng·L-1。胚胎回收時平均AMH濃度為(50.40±1.67)ng·L-1，最大值為116.64 ng·L-1，最小值34.48 ng·L-1，上四分位數為54.44 ng·L-1，下四分位數為40.74 ng·L-1。因此，為明確各個時間點AMH濃度的篩選閾值，本研究將不同時期的外周血AMH濃度按照高(濃度分布最高的25%)、中等(濃度分布中間的25%～75%)、低(濃度分布最低的25%)分為3組，并檢驗了這3組之間頭均回收胚胎數、頭均可用胚胎數、頭均退化胚胎數和頭均未受精卵母細胞數等指標間的差異。

圖2 體內胚胎生產不同時間點供體牛外周血AMH濃度的分布圖

2.2 CIDR埋置時外周血AMH濃度對胚胎生產效率的影響

CIDR埋置時外周血AMH濃度對胚胎生產效率的影響分析結果見表1。從表1可以看出，外周血AMH濃度對頭均回收胚胎數和頭均未受精卵母細胞數均有顯著影響(P<0.05)，高濃度組頭均回收胚胎數(9.38枚)顯著高于中等濃度組(6.47枚)(P<0.05)，高濃度組頭均未受精卵母細胞數(2.15枚)顯著高于其余兩組(P<0.05)，說明CIDR埋置時外周血中高AMH濃度可能會刺激更多卵泡募集和發育，后期FSH處理后形成更多的優勢卵泡排卵。但是，頭均回收胚胎數增加的同時頭均未受精卵母細胞數也顯著增加，這可能是因為人工輸精時間與排卵時間不吻合導致，高濃度組更多的優勢卵泡排卵，但是排卵時間不一致，排卵周期更長，因此觀察到發情后12 h配種可能并不能覆蓋所有排卵的卵母細胞，導致部分后排或者先排的卵母細胞未能受精，后續應進一步細化研究其影響機制。

表1 CIDR埋置時母牛血清中AMH濃度與胚胎生產效率的關系

2.3 人工輸精時外周血AMH濃度對胚胎生產效率的影響

人工輸精時外周血AMH濃度對胚胎生產效率的影響分析結果見表2。從表2可以看出，人工輸精時外周血AMH濃度對頭均回收胚胎數、頭均可用胚胎數、頭均退化胚胎數和頭均未受精卵母細胞數均無顯著影響(P>0.05)。人工輸精時大多數優勢卵泡已經排卵，AMH濃度明顯低于CIDR 埋置時，這與Maggi等[3]的研究結果一致，隨著卵泡的發育，AMH濃度逐漸降低。但是，總體來看，高濃度組的體內胚胎生產效率最低，無論是頭均回收胚胎數，還是頭均可用胚胎數均低于其余兩組，且頭均退化胚胎數和頭均未受精卵母細胞數均最高，高濃度AMH代表高組還有部分卵泡沒有排卵，從而導致高濃度組頭均可用胚胎和胚胎總數均降低。

表2 人工輸精時母牛血清中AMH濃度與胚胎生產效率的關系

2.4 胚胎回收時外周血AMH濃度對胚胎生產效率的影響

胚胎回收時外周血AMH濃度對胚胎生產效率的影響分析結果見表3。從表3可以看出，胚胎回收時外周血AMH濃度對頭均回收胚胎數、頭均可用胚胎數、頭均退化胚胎數和頭均未受精卵母細胞數均無顯著影響(P>0.05)，這可能是因為當體內胚胎生產執行到胚胎回收時，卵巢上黃體正處于發育期，機體內孕酮含量高，卵泡發育被抑制，此時AMH濃度高的牛只可能說明下一個發情周期時其卵泡募集和發育數量多，并不能作為體內胚胎生產效率的標記之一。

表3 回收胚胎時母牛血清中AMH濃度與胚胎生產效率的關系

2.5 體重對胚胎生產效率的影響

在研究體內胚胎生產中3個時間點(CIDR埋置、人工輸精和胚胎回收)外周血AMH濃度對體內胚胎生產效率的影響以外，本研究還收集了本次試驗92頭供體牛體重數據，按照“平均值±3倍標準差”篩選后，按照高(分布最高的25%，>384 kg)、中等(濃度分布中間的25%～75%，350～384 kg)、低(濃度分布最低的25%，<350 kg)分為3組，用于分析體重與體內胚胎生產效率之間的關系。從表4中可以看出，雖然各組間沒有顯著差異(P>0.05)，但是高體重組頭均可用胚胎數、頭均回收胚胎數均低于中等體重組和低體重組，其中，中等體重組最優，說明體重適中更適合體內胚胎生產，過胖或過瘦都有可能會影響體內胚胎生產效率。

表4 供體牛體重與胚胎生產效率的關系

3 討 論

超數排卵生產體內胚胎是牛胚胎移植商業應用獲得胚胎來源的重要途徑之一[27-29]。雖然研究人員一直在不斷改進牛胚胎生產與移植技術，但是超數排卵后供體平均獲得可用胚胎數在過去幾十年里也沒有顯著提高，平均可用胚胎數仍為6～7枚，這可能與供體母牛對超數排卵反應差異較大，即超數排卵時卵巢狀態有關[30-31]。研究發現，牛外周血液中AMH含量與母牛卵巢活性、有腔卵泡數量和卵泡質量有關[24]。

AMH發揮生物學功能需要與顆粒細胞上的AMH受體Ⅰ型(AMHR1)和Ⅱ型(AMHR2)二聚體結合，隨后啟動AMH的信號傳導過程。Poole等[32]研究發現，小卵泡(5～8 mm)中AMH受體比大卵泡(13～24 mm)的數量更多，說明年輕卵泡比老年卵泡產生更多的AMH。Monniaux等[10]研究也發現，隨著奶牛卵泡直徑的增加，AMH的濃度顯著下降，說明AMH主要在卵泡發育前期發揮作用，例如卵泡募集等。因而，外周血液AMH含量可能與超數排卵后供體母牛獲得胚胎數量有關，高濃度AMH組牛只超排后可見更多的優勢卵泡或可以通過活體采卵回收到更多的卵丘-卵母細胞復合體，Monniaux等[10]研究發現，血液AMH濃度在100～200 pg·mL-1之間和大于200 pg·mL-1的供體母牛頭均獲得胚胎數和可用胚胎數均顯著高于AMH濃度低于100 pg·mL-1的供體牛。畢江華等[33]等重復超數排卵荷斯坦供體母牛發現，血液中AMH含量在1 000～1 100 pg·mL-1的供體牛體內胚胎生產效率顯著高于含量在500～800 pg·mL-1的供體母牛，因此，外周血AMH濃度可作為預測供體胚胎產量的一項內分泌指標[34]。但是上述研究測定的都是采集胚胎后供體血清中AMH濃度，且每組試驗牛數量較少。

因此，本試驗增加多個采樣點，旨在研究供體牛超排過程中不同時間外周血AMH濃度與荷斯坦奶牛體內胚胎生產效率的相關性，優化供體牛篩選標準，以提高體內胚胎生產效率。經分析發現，CIDR埋置時，外周血AMH濃度對胚胎生產效率有顯著影響，高AMH濃度組頭均回收胚胎數(9.38枚)顯著高于其余兩組(6.47和7.50枚)，說明CIDR埋置時外周血中高AMH濃度可能會刺激更多卵泡募集和發育，后期FSH處理后形成更多的優勢卵泡排卵。但是，頭均回收胚胎數增加的同時頭均未受精數也顯著增加，這可能是因為人工輸精時間與排卵時間不吻合導致，雖然高AMH濃度組有更多的優勢卵泡排卵，但是排卵時間不一致，排卵周期可能更長，因此，觀察到發情后12 h配種可能并不能覆蓋所有排卵的卵母細胞，導致部分后排或者先排的卵母細胞未能受精。上述結果說明，不僅開始超數排卵時供體牛卵巢對FSH的反應可影響超數排卵效果，而且超數排卵處理前供體牛外周血AMH濃度也直接影響超數排卵獲得的胚胎總數和可用胚胎數[35-36]。后續應針對高AMH濃度組未受精卵的增加開展進一步研究，以進一步提高高AMH濃度組的可用胚胎數。此外，依托供體牛體重數據分析發現，盡管不同體重組之間體內胚胎的生產效率無顯著性差異，但是，體況適中組牛只的可用胚胎數、回收胚胎數等均優于其他兩組，尤其是優于體重偏胖組，這與Souza 等[11]的研究結果一致，說明體重適中更適合體內胚胎生產，過胖或過瘦都有可能會影響體內胚胎生產效率。

4 結 論

本試驗結果表明，在華北地區現有的生產管理水平下，荷斯坦青年牛超排前外周血AMH濃度可以一定程度反映供體牛超排的效果，高AMH濃度牛只的胚胎總數更多，可以作為供體牛篩選條件之一，且供體牛選擇時宜選用體況適中的牛只。本研究結果對荷斯坦青年奶牛體內胚胎高效生產和核心群的建立具有一定的參考價值。