TNFRSF10B在直腸癌中的表達及臨床意義*

王明輝，張朝永，劉越軍，張 健，張四新

1.河北省唐山市中醫醫院普外科，河北唐山 063000；2.中國人民解放軍陸軍第82集團軍醫院普外科，河北保定 071000

近年來，直腸癌的發病率逐年上升，患病人群越來越年輕化，成為僅次于肺癌的致命惡性腫瘤[1-2]。調查表明，直腸癌與人群的飲食、生活方式和基因遺傳性等有關[3-4]，但其具體發病機制尚不明確。從分子水平研究影響直腸癌發生、發展的相關因子，尋找新的治療靶點有利于直腸癌的防治。腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF)10B屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)的受體，參與多種腫瘤細胞的凋亡過程[5]。有研究報道，TNFRSF10可以激活腫瘤細胞中TRAIL凋亡途徑，促進腫瘤細胞凋亡[6]。目前，關于TNFRSF10B的表達與直腸癌關系的研究較少，本研究采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和免疫組織化學染色法檢測TNFRSF10B在直腸癌中的表達水平，分析其與患者臨床病理特征和預后的關系，以期為直腸癌的治療及預后評估提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年9月至2017年7月在唐山市中醫醫院進行手術治療的直腸癌患者87例為研究對象，其中男50例，女37例；平均年齡(54.65±3.10)歲；臨床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；腫瘤分化程度：低分化30例，中、高分化57例；有淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移44例；有遠處轉移45例，無遠處轉移42例。納入標準：(1)病理檢查確診為原發性直腸癌；(2)臨床及隨訪資料完整；(3)術前未進行放、化療。排除標準：(1)合并心、腎、肝等重要器官功能障礙；(2)合并精神疾病；(3)合并其他部位腫瘤。本研究獲得唐山市中醫醫院醫學倫理委員會審查批準，患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑(批號：TR118-100)購自上海素爾生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒(批號：RR047A)購自日本Takara公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix RT-qPCR試劑盒(批號：Q111-02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；免疫組織化學染色法檢測試劑盒(批號：QN2715)、羊抗兔IgG二抗(批號：QN2732-PWV)均購自北京百奧萊博科技有限公司；檸檬酸抗原修復液(批號：C1031)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(批號：DA1010)購自北京索萊寶科技有限公司；TNFRSF10B兔抗人單克隆抗體(批號：BW5737)購自美國Santa公司；RT-qPCR儀(型號：SLAN-96P)購自上海宏石醫療科技有限公司；光學顯微鏡(型號：DM6M LIBS)購自德國徠卡公司；RT-qPCR所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR檢測直腸癌組織和癌旁組織中TNFRSF10B mRNA的表達 取研究對象的直腸癌組織及癌旁組織標本，按照Trizol試劑盒說明書，提取組織RNA，注意組織研磨時應在冰盒上快速進行，提取后檢測其濃度，用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒進行反轉錄。配制RT-qPCR反應體系20 μL，每個標本重復檢測3次，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，PCR反應條件：預變性95 ℃ 30 s，40個循環，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，延伸70 ℃ 10 s。TNFRSF10B引物序列：上游引物5′-CGGGCAGATCACTACACCC-3′，下游引物5′-AGTTCCCTTCTGACAGGTACTG-3′；GAPDH引物序列：上游引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。反應結束后，TNFRSF10B相對表達水平用2-ΔΔCt計算。

1.3.2免疫組織化學染色法檢測直腸癌組織和癌旁組織中TNFRSF10B蛋白的表達 將直腸癌組織及癌旁組織固定、脫水、石蠟包埋后連續切片，切片厚度約5 μm，免疫組織化學染色采用兩步法，加兔抗人TNFRSF10B一抗(1∶150)，二甲苯脫蠟、水化，置于檸檬酸修復液中，高壓修復抗原，孵育一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素復染，溫水返藍，脫水、中性樹脂進行封片，觀察。TNFRSF10B染色結果從染色細胞百分比和染色強度兩方面進行綜合判斷，(1)根據染色強度記分：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；(2)根據陽性細胞百分比記分：<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分。染色強度和陽性細胞百分比記分相乘的值≤3分為低表達，>3分為高表達[7]。

1.3.3隨訪 術后對直腸癌患者均進行為期3年的隨訪，隨訪方式為門診復查和電話隨訪，每3個月隨訪1次，如患者在隨訪期內死亡則以死亡日期作為隨訪截止日期。

2 結 果

2.1TNFRSF10B mRNA在癌旁組織和直腸癌組織中的表達水平比較 癌旁組織中TNFRSF10B mRNA的表達水平(1.30±0.12)明顯低于直腸癌組織中TNFRSF10B mRNA的表達水平(2.62±0.15)，差異有統計學意義(t=64.094，P<0.05)。

2.2TNFRSF10B蛋白在癌旁組織和直腸癌組織中的高表達率比較 癌旁組織中TNFRSF10B蛋白的高表達率為13.79%，明顯低于直腸癌組織中TNFRSF10B蛋白的高表達率(54.02%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

注：A為TNFRSF10B蛋白在癌旁組織中的表達；B為TNFRSF10B蛋白在直腸癌組織中的表達。圖1 TNFRSF10B蛋白在癌旁組織和直腸癌組織中的表達情況(×400)

表1 TNFRSF10B蛋白在直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況[n(%)]

2.3TNFRSF10B蛋白表達與直腸癌患者臨床病理特征的關系 TNFRSF10B蛋白表達與直腸癌患者臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移有關(P<0.05)，與患者性別、年齡無關(P>0.05)。見表2。

表2 TNFRSF10B蛋白表達與直腸癌患者臨床病理特征的關系(n)

2.4TNFRSF10B蛋白表達對直腸癌患者生存情況的影響 TNFRSF10B蛋白高表達的直腸癌患者3年生存率為57.45%(27/47)，低于TNFRSF10B蛋白低表達直腸癌患者的3年生存率[80.00%(32/40)]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5預后影響因素分析 單因素分析結果顯示，TNFRSF10B蛋白表達情況、臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移是直腸癌患者預后的影響因素(P<0.05)。多因素分析結果顯示，TNFRSF10B蛋白高表達、臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移是影響直腸癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響直腸癌患者預后的危險因素分析

3 討 論

直腸癌是發病率和病死率較高的惡性腫瘤之一，目前，早期直腸癌的治療多以手術為主，中晚期直腸癌多采用放療和化療，然而治療后易復發，嚴重影響著患者的身體健康和生命安全[8-9]。隨著生物科學技術的發展，從分子水平尋找直腸癌患者的預后預測指標已成為研究的熱點。TNFRSF有多種生物學功能，在炎性反應、腫瘤、人體免疫等方面發揮著重要作用，TNFRSF與其受體結合后可以激活炎性反應，促進炎癥信號傳遞，與機體炎癥免疫相關[10-11]。韓翰等[12]研究發現，TNFRSF10B的表達影響乳腺癌細胞的自噬作用。大量研究表明，激活TRAIL及其受體TNFRSF10B可有效促進胃癌、宮頸癌、胰腺癌等癌細胞的凋亡[13-15]。TNFRSF10B在多種腫瘤疾病中發揮著重要作用，但關于TNFRSF10B在直腸癌中的研究報道較少，因此研究其表達與直腸癌發生、發展的關系具有一定的必要性。本研究發現，TNFRSF10B mRNA及蛋白在直腸癌組織中高表達，與部分研究發現的宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌中TNFRSF10B高表達的結果一致[12-15]，提示TNFRSF10B高表達與直腸癌發生有關，其高表達可能與機體在腫瘤發生時的主動抗腫瘤自衛機制有關。

研究發現，TNFRSF10B在膀胱癌組織中高表達，褪黑素能通過影響TNFRSF10B的表達水平，從而促進膀胱癌細胞凋亡[16]。RASHEDUZZAMAN等[17]研究表明，非小細胞肺癌細胞中TNFRSF10B呈高表達，替米沙坦可以增強TRAIL的敏感性，促進腫瘤細胞調亡。ROMAGUERA等[18]研究發現，TNFRSF10B在淋巴瘤患者中高表達，且參與淋巴瘤的發生、發展過程。以上研究提示TNFRSF10B在腫瘤細胞凋亡過程中發揮重要作用。腫瘤患者的預后與腫瘤細胞增殖、凋亡等密切相關。本研究結果顯示，TNFRSF10B蛋白在直腸癌組織中的表達與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移有關，提示TNFRSF10B的表達可能參與直腸癌的發生、發展過程，然而具體機制有待進一步研究。本研究中，TNFRSF10B蛋白低表達的直腸癌患者3年生存率高于TNFRSF10B蛋白高表達的直腸癌患者，進一步行多因素Cox回歸分析結果顯示，TNFRSF10B蛋白高表達、臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移是影響直腸癌患者預后的獨立危險因素，提示應加強對TNFRSF10B高表達、臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移的直腸癌患者的隨訪，關注其病情變化，并及時給予治療，從而改善患者預后。

綜上所述，TNFRSF10B在直腸癌組織中高表達，與直腸癌的發生、發展相關，對直腸癌患者預后評估有一定的指導意義。