廣泛耐藥鮑曼不動桿菌β-內酰胺酶耐藥基因分析

鄭 琳，張幫林，李 萌，顧成武

1.四川省瀘州市中醫醫院檢驗科，四川瀘州 646000；2.四川省遂寧市中心醫院神經內科，四川遂寧 629000

近年來，鮑曼不動桿菌(Ab)感染不斷增多，且隨著廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛使用，全球各地陸續出現多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAb)或廣泛耐藥鮑曼不動桿菌(XDRAb)感染的報道。KARAMPATAKIS等[1]發現，Ab亞胺培南耐藥菌株分離率從2017年的27.6%增長至2018年的31.0%。國內王宇航等[2]近年來的研究發現，桂林地區Ab對多種類型抗菌藥物，如廣譜青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類呈現高度耐藥及嚴重的多重耐藥現狀，耐藥率高于60%。Ab的耐藥機制復雜，產β-內酰胺酶是其耐藥的主要機制，β-內酰胺酶根據水解對象不同可分為青霉素酶(OXA)、頭孢菌素酶(AmpC)、金屬類β-內酰胺酶(MBLs)和超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)4種。隨著臨床β-內酰胺類抗菌藥物的廣泛應用、耐藥率的不斷上升，以及新的β-內酰胺類抗菌藥物的不斷開發，對β-內酰胺酶耐藥基因的研究越來越受到重視[3]。本研究通過探討Ab的耐藥情況及XDRAb β-內酰胺酶耐藥基因的主要分布情況，以期為臨床預防和治療XDRAb感染提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取瀘州市中醫醫院(以下稱本院)臨床送檢標本中分離的102株Ab(非重復菌株)，所有菌株經法國生物梅里埃公司生產的VITEK2 COMPACT全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定確認，其中來自ICU的有44株(43.14%)，心胸外科17株(16.67%)，燒傷科12株(11.76%)，骨傷科14株(13.73%)，呼吸內科8株(7.84%)，神經內科3株(2.94%)，泌尿外科2株(1.96%)，新生兒科1株(0.98%)，婦產科1株(0.98%)；來自痰液標本62株(60.78%)，膿液標本20株(19.61%)，血液標本8株(7.84%)，腦脊液標本3株(2.94%)，傷口分泌物標本3株(2.94%)，尿液標本2株(1.96%)，引流液標本2株(1.96%)，穿刺液標本2株(1.96%)。質控菌株：銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603(產ESBLs株)購自中華人民共和國國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。肺炎克雷伯菌(IMP-4基因陽性菌株)由本院微生物室提供，已鑒定并測序。

1.2儀器與試劑 主要儀器：VITEK2 COMPACT全自動細菌鑒定藥敏分析儀，PCR擴增儀，低溫離心機，金屬浴加熱儀，35 ℃恒溫孵育箱，瓊脂糖凝膠電泳儀，-80 ℃和-20 ℃冰箱，高壓滅菌鍋，PCR 96孔反應板，10 μL、100 μL、1 000 μL加樣槍和槍頭，2.0 mL EP管等。主要試劑：Takara PreMix Taq購自日本Takara公司,DNA MarkerⅡ購自天根生化科技(北京)有限公司,31種引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗 臨床常用抗菌藥物(米諾環素除外)采用VITEK2 COMPACT全自動細菌鑒定藥敏分析儀高通量測序技術檢測，分析敏感、中介及耐藥率。頭孢哌酮/舒巴坦(SCF105)、米諾環素(MH30)、替加環素(TGC15)、多黏菌素E(CT10)采用紙片擴散(K-B)法檢測，量取藥物抑菌環直徑，結果按照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)相關標準進行判讀 (CLSI未提供頭孢哌酮/舒巴坦的K-B法判讀標準，故其按照頭孢哌酮的標準進行判讀)。

1.3.2DNA模板制備 采用煮沸法，將細菌在麥康凱培養基上復蘇培養12 h，用棉簽挑取適量菌落于2.0 mL EP管中(預先加入1.5 mL生理鹽水)，12 000 r/min離心2 min，去除部分上清，混勻，100 ℃煮沸20 min，12 000 r/min低溫離心10 min，所得上清液即為所需DNA模板液。

1.3.3DNA PCR擴增 細菌DNA與引物進行PCR擴增，各種靶基因PCR擴增體系均為正向引物、反向引物各1 μL(10 mmol/L)，Takara PreMix Taq 10 μL，超純水5 μL，模板液3 μL，總反應體積20 μL。PCR反應參數如下：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環35次，最終72 ℃延伸5 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后在紫外凝膠成像儀下觀察、記錄并拍照。部分基因引物序列見表1。

表1 部分基因引物序列

續表1 部分基因引物序列

1.4統計學處理 采用Excel 2010進行數據統計與分析。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 分離的102株Ab對臨床常用的抗菌藥物中除米諾環素的耐藥率較低(32.35%)外，對其他抗菌藥物的耐藥率均較高，為XDRAb菌株。其中亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為74.51%和70.59%；對氨芐西林、呋喃妥因、頭孢唑啉和頭孢替坦為全耐藥；對替加環素耐藥率較低，為7.84%。多黏菌素E因無K-B法的CLSI判讀標準，故根據抑菌環直徑來判斷耐藥性，其抑菌環直徑97.06%在11～17 mm，耐藥率低。見表2。

表2 藥敏試驗結果

續表2 藥敏試驗結果

2.2β-內酰胺酶耐藥基因檢測結果 OXA基因中，OXA-20、23、24、51陽性率分別為4.90%、58.82%、24.51%、76.47%，插入序列ISA-OXA-23和ISA-OXA-51陽性率分別為63.73%和21.57%，未檢測出OXA-58基因。ESBLs基因中，TEM陽性率較高，為76.47%，SHV陽性率低，為9.80%。AmpC基因中，ADC陽性率較高，為85.29%，DHA陽性率較低，為23.53%。MBLs基因中,IMP-4和VIM陽性率分別為18.63%和20.59%，CTX-M1陽性率為11.76%，PER和GES陽性率低，均為6.86%，Ⅰ類整合基因INT-1陽性率為11.76%。其余MBLs基因CTX-M2、CTX-M8、CTX-M9、CTX-M25、KPC、VEB、CARB、LAP、SCO、SIM、SPM、GIM、AIM、NDM均未檢出。存在3種以上不同類型基因陽性的菌株有76株，占74.51%。見表3。

表3 β-內酰胺酶耐藥基因陽性率分布

3 討 論

Ab是引起醫院感染的病原菌之一，可引起呼吸道、血液、泌尿道、傷口等多部位感染，有較高的病死率[4-5]。Ab耐藥率高，耐藥性強，同時耐藥性可克隆傳播,臨床治療較為困難[6-7]。本研究62株Ab來自痰液標本，占60.78%。丁丹[8]連續7年的監測結果顯示，Ab以感染下呼吸道為主(76.00%)。結合本研究結果，提示Ab最常見的感染部位為呼吸道。藥敏試驗結果顯示，本院分離到的Ab耐藥率高，且耐藥廣泛，對氨芐西林、呋喃妥因、頭孢唑啉和頭孢替坦為全耐藥，對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為74.51%、71.57%和70.59%，為XDRAb菌株。出現該結果可能與抗菌藥物的廣泛應用和Ab的耐藥機制復雜密切相關[9-10]?；驒z測結果顯示，XDRAb的β-內酰胺酶耐藥基因分布較廣，以TEM、OXA-23、OXA-51及ADC為主，表明本院分離的XDRAb對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥主要與TEM、OXA-23、OXA-51及ADC基因表達有關。本研究也檢測到以往檢出率較低的MBLs基因中的IMP-4和VIM，陽性率分別為18.63%和20.59%。本研究3種以上不同類型基因陽性的菌株有76株，占74.51%，故認為本院分離的XDRAb耐藥與同時攜帶多種耐藥基因也有關。本研究根據IMP陽性質控菌株與PCR擴增產物電泳條帶分析，檢出IMP的19株Ab均為IMP-4陽性，但電泳條帶顯示某些菌株還存在其他長度的IMP基因型，可能為IMP基因的某種亞型，有待進一步對產物進行測序分析。另外，某些菌株OXA-23和ISA-OXA-23的電泳結果中除目的產物外，還出現1或2個條帶，但根據設計引物的產物長度，這些條帶顯示出與目的產物相差較大，可能是由于引物設計的特異度不高導致非特異性擴增所致，也可能是OXA-23的變異產物，結果有待進一步分析及研究驗證。

近年來，由于廣譜抗菌藥物的廣泛使用，由Ab引起的醫院感染逐年增多，該菌的分離率及耐藥率也呈逐年上升趨勢[11]，Ab感染已成為難以治療和控制的院內獲得性感染類型[12]。本院分離的XDRAb耐藥嚴重，對抗菌藥物敏感率低，其β-內酰胺酶耐藥基因分布較廣泛，常見耐藥基因陽性率高，且同時攜帶多種β-內酰胺酶耐藥基因。了解XDRAb感染的危險因素，研究其耐藥機制，對防治XDRAb感染及減少醫院感染、交叉耐藥尤為重要。

綜上所述，本院分離的Ab為XDRAb菌株，β-內酰胺酶耐藥基因分布較廣泛，存在耐藥基因TEM、OXA-23、OXA-51、ADC等是其耐藥的主要原因，醫院應加強對XDRAb感染的防控，減少醫院交叉感染。