雙重過濾法聯(lián)合MALDI-TOF MS快速檢測尿液病原菌*

徐金蓮，陳學兵，李書琴，肖學會，王沛(荊門市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北荊門448000)

尿路感染是人類較常見的感染性疾病，作為診斷金標準的中段尿細菌定量培養(yǎng)耗時長且存在培養(yǎng)陰性現(xiàn)象，不利于臨床快速診斷及排除尿路感染。UF1000i尿沉渣自動化分析儀能準確提供白細胞和細菌含量，常用于尿路感染的篩查。全自動細菌鑒定分析儀雖可于當日完成病原菌鑒定，然而鑒定前需培養(yǎng)出單菌落。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)具有快速鑒定病原菌的優(yōu)點，可將已培養(yǎng)的病原菌鑒定時間縮短至數(shù)分鐘，成為臨床實驗室的常規(guī)鑒定方法[1]。MALDI-TOF MS還能直接檢測陽性血培養(yǎng)和尿液等體液中的病原菌，省去了培養(yǎng)環(huán)節(jié)，進一步縮短了病原菌的鑒定時間[2-3]。由于標本中存在影響質譜峰質量的細胞、蛋白質等干擾因素，需要對標本中病原菌富集純化后方可提高MALDI-TOF MS鑒定的準確率。目前國內外學者采用的富集純化方法處理時間均較長，操作繁瑣。本研究利用UF1000i細菌計數(shù)結果對中段尿標本進行初篩，應用2個針式過濾器組成的雙重過濾器對初篩陽性的中段尿標本進行雙重過濾以富集純化病原菌，運用MALDI-TOF MS對濾膜上富集的病原菌進行鑒定，旨在為臨床尿路感染病原菌的快速診斷提供簡單可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1標本來源及處理 收集2020年5—8月荊門市第一人民醫(yī)院門診及住院疑似尿路感染患者中段尿標本1 583份。標本采集量約20 mL，并分為3份，分別用于細菌定量培養(yǎng)及鑒定、UF1000i細菌計數(shù)和細菌計數(shù)陽性標本的過濾集菌及鑒定。

1.2主要儀器與試劑 UF1000i全自動尿沉渣分析儀、UFII PACK-BAC稀釋液(日本希森美康公司)；microflex LT MALDI-TOF質譜分析儀、樣品處理基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、大腸埃希菌DH5α(德國布魯克道爾頓公司)；哥倫比亞血瓊脂及麥康凱瓊脂(鄭州安圖生物公司)；一次性水系針式過濾器、水系微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)，可換膜針式過濾器(桃園醫(yī)療化工儀器廠)；甲酸、三氟乙酸及乙腈(天津市大茂化學試劑廠)。

1.3雙重過濾器制作 上層預過濾濾器為5 μm孔徑一次性密閉針式過濾器，下層濾器為可放置不同孔徑微孔濾膜的可換膜針式過濾器，兩個過濾器直接串聯(lián)成雙重過濾器。過濾尿液時，先將浸泡于去離子水中的0.45 μm微孔濾膜置于可換膜針式過濾器中，再將裝有尿液標本的注射器插入雙重過濾器接口，按壓過濾。雙重過濾器示意圖見圖1。

圖1 雙重過濾器示意圖

1.4細菌定量培養(yǎng)及鑒定 分別取10 μL中段尿接種血瓊脂平板和麥康凱平板，置35 ℃培養(yǎng)18～48 h。將菌落計數(shù)≥104CFU/mL菌落用牙簽挑取少許涂抹于靶板中，加入1 μL 70%甲酸溶液，待其自然干燥后，再加入1 μL配制好的基質溶液，自然晾干后將靶板放入質譜分析儀進行MALDI-TOF MS鑒定。參考衛(wèi)生行業(yè)標準《WS/T489-2016尿路感染臨床微生物實驗室診斷》[4]，對細菌菌落計數(shù)≥104CFU/mL的中段尿標本進行細菌鑒定。2種菌生長標本僅優(yōu)勢菌納入鑒定范圍，培養(yǎng)后菌落數(shù)占比>50%的細菌判斷為優(yōu)勢菌。2種以上細菌生長標本視為污染菌，不納入本研究。

1.5UF1000i細菌計數(shù) 取中段尿3 mL，按UF1000i全自動尿沉渣分析儀要求進行細菌(包括真菌)計數(shù)檢測。參考文獻[5]，細菌計數(shù)閾值判斷標準為≥105個/mL。

1.6雙重過濾法集菌及鑒定 用無菌注射器抽取UF1000i細菌計數(shù)≥105個/mL的中段尿5 mL，插入雙重過濾器接口，輕輕按壓注射器過濾尿液，過濾完畢后吸取1 mL無菌去離子水洗滌過濾。用接種環(huán)刮取下層過濾器濾膜上的細菌并涂抹于靶板，按常規(guī)方法操作并進行MALDI-TOF MS鑒定。同時將濾膜上的刮取物涂抹于潔凈的玻片上進行快速革蘭染色。MALDI-TOF MS鑒定結果判斷：當鑒定分值≥1.700時為鑒定結果可信，鑒定分值<1.700時為鑒定結果不可信。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例數(shù)或百分數(shù)表示。利用配對χ2檢驗及Kappa一致性檢驗，分別比較UF1000i細菌計數(shù)與定量培養(yǎng)、雙重過濾法與培養(yǎng)法檢測結果差異及一致性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1UF1000i細菌計數(shù)及與定量培養(yǎng)結果比較 1 583份中段尿標本中，UF1000i篩選出細菌計數(shù)≥105個/mL標本381份(24.1%)，其中培養(yǎng)后菌落數(shù)<104CFU/mL標本109份，菌落數(shù)≥104CFU/mL標本272份；1 202份細菌計數(shù)<105個/mL標本中，培養(yǎng)后菌落數(shù)<104CFU/mL標本1 183份，菌落數(shù)≥104CFU/mL標本19份，細菌漏檢率為6.5%(19/291)。見表1。UF1000i細菌計數(shù)閾值設置為≥105個/mL時，UF1000i細菌計數(shù)與定量培養(yǎng)結果的陽性符合率為93.5%(272/291)，陰性符合率為91.6%(1 183/1 292)，總符合率為91.9%(1 455/1 583)。2種方法陽性率間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但檢測結果一致性較好(kappa=0.759)。

表1 UF1000i細菌計數(shù)與細菌定量培養(yǎng)結果比較

2.2雙重過濾法與培養(yǎng)法鑒定結果比較 細菌培養(yǎng)菌落數(shù)≥104CFU/mL且為單一菌生長標本共229份，其中，雙重過濾法鑒定出細菌的標本為211份，鑒定符合率為92.1%(211/229)，其中革蘭陰性菌鑒定符合率為94.7%(177/187)，革蘭陽性菌鑒定符合率為84.6%(33/39)，真菌鑒定符合率為33.3%(1/3)。43份標本為2種菌混合生長，雙重過濾法未能可靠地鑒定出2種混合菌，鑒定的細菌主要為優(yōu)勢菌，鑒定符合率為72.1%(31/43)。見表2。381份UF1000i細菌計數(shù)陽性的中段尿標本中，272份標本菌落數(shù)≥104CFU/mL，雙重過濾法鑒定出細菌生長標本242份，與培養(yǎng)法的鑒定符合率為89.0%(242/272)。2種方法檢測結果比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但一致性較好(kappa=0.822)。

表2 雙重過濾法與培養(yǎng)法鑒定結果比較

2.3雙重過濾法與培養(yǎng)法中段尿標本處理流程及周轉時間比較 雙重過濾法利用UF1000i細菌計數(shù)對尿液標本進行快速初篩，初篩陽性標本雙重過濾集菌后直接進行MALDI-TOF MS鑒定。2種方法的中段尿標本處理流程見圖2。傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作簡單，但中段尿標本周轉時間約需18～48 h。雙重過濾法在收到標本后的5 min內完成細菌計數(shù)，15 min內完成標本過濾集菌及靶板點樣，30 min內完成細菌鑒定。雙重過濾法中最為關鍵的尿液標本過濾集菌僅需2～3 min。

圖2 培養(yǎng)法、雙重過濾法的標本處理流程與時間軸

3 討論

本研究運用的微孔濾膜雙重過濾法采用2個針式過濾器直接串聯(lián)成的雙重過濾器，2～3 min內完成尿液標本的過濾集菌，耗時短，過濾效率高，操作簡單，該雙重過濾方法聯(lián)合UF1000i細菌計數(shù)和MALDI-TOF MS直接對尿液中的病原菌進行快速準確的鑒定，為臨床尿路感染快速診斷及治療提供科學依據(jù)。

鑒于MALDI-TOF MS直接檢測尿液中病原菌的菌量至少需要105CFU/mL[6]，以及尿路感染患者尿液中的病原菌菌落數(shù)通常高于104～105CFU/mL[7]，本研究通過UF1000i細菌計數(shù)來確定尿液標本是否需要進行過濾集菌及鑒定。1 583份尿液檢測結果顯示，UF1000i細菌計數(shù)與定量培養(yǎng)結果的符合率達到91.9%，2種方法檢測結果的一致性較好(kappa=0.822)。研究表明，通過合適的閾值設置，UF1000i細菌計數(shù)可作為MALDI-TOF直接檢測尿液中病原菌的檢測指征與尿路感染的初篩指標，快速篩選出培養(yǎng)陰性占大多數(shù)的尿液標本，減少過濾及鑒定工作量。UF1000i細菌計數(shù)也正好彌補雙重過濾法不能計數(shù)尿液病原菌的不足。此外，由于標本中細菌濃度與MALDI-TOF MS鑒定能力具有相關性[8]，對UF1000i細菌計數(shù)結果不高(105～106個/mL)的尿液標本，可以通過增加尿量或使用小過濾器的方法以增加富集的菌量，從而提高MALDI-TOF MS鑒定率。

本研究中，雙重過濾法對229份單一菌生長尿液標本過濾集菌后的MALDI-TOF MS鑒定結果與培養(yǎng)法鑒定結果的符合率為92.1%，其中革蘭陰性菌鑒定符合率達到94.7%，革蘭陽性菌鑒定符合率為84.6%。3份真菌生長標本只鑒定出了1份，還有10份革蘭陰性桿菌生長標本和6份革蘭陽性球菌生長標本未能成功鑒定，可能與以下因素有關。(1)富集菌中有干擾因素。本研究中所用的上層預過濾器的濾膜孔徑為5 μm，只能濾除大多數(shù)直徑大于5 μm的有形成分，不被截留的小于5 μm的有形成分可能會留在下層0.45 μm孔徑過濾膜上，從而影響MALDI-TOF MS鑒定。因此，雙重過濾并不能完全去除尿液中的細胞及細胞破碎物、蛋白質、色素物質等可能的干擾因素。本研究對5份無鑒定結果標本的濾膜取菌涂片，革蘭染色后發(fā)現(xiàn)有較多富集菌，但背景不干凈，可能因干擾物質影響鑒定結果。(2)富集菌量較少。尿液經預過濾器過濾會被截留部分細菌，菌量不高的尿液標本過濾后富集菌量更少，使MALDI-TOF MS檢測能力明顯降低[6,9-10]。此外，尿液中的真菌孢子、呈鏈狀排列或聚集成團的革蘭陽性球菌及菌體長的細菌均大于預過濾器的濾膜孔徑，會使過濾后的菌量大大減少。本研究中分別有3份腸球菌與2份葡萄球菌生長標本均由于細菌聚集，不能從5 μm濾膜濾出導致無鑒定結果。研究發(fā)現(xiàn)，當標本中菌量不高，而尿液中細胞、結晶等異常成分比較多時，尿液標本常常也無可靠鑒定結果。(3)細菌破壁效果不好。本研究中真菌鑒定率低，除了與富集菌量少有關，也可能與真菌細胞壁較難破壞有關[3,11-12]。本研究中雙重過濾法對混合菌生長尿液標本鑒定率雖可達到72.1%，但鑒定的細菌主要為優(yōu)勢菌。由于混合菌檢測是MALDI-TOF MS技術的短板，故雙重過濾法不適合混合菌生長標本的鑒定。

MALDI-TOF MS直接檢測尿液中病原菌的關鍵之處在于如何純化富集病原菌。富集的菌量及細菌的純度與MALDI-TOF MS鑒定的準確性具有相關性。目前文獻報道的純化富集尿液病原菌的方法主要有離心法、短期培養(yǎng)法和負壓式過濾法[3,13-14]。研究顯示，離心法聯(lián)合MALDI-TOF MS對尿液單一菌生長標本準確度介于68.4%～92.9%[3,14]。短期培養(yǎng)法聯(lián)合MALDI-TOF MS鑒定尿液病原菌，4 h培養(yǎng)單一菌檢出率為80.1%，6 h培養(yǎng)檢出率可達97.1%[13]。國外Veron等[14]采用負壓過濾法聯(lián)合MALDI-TOF MS檢測尿液病原菌的準確度為78.9%，高于差速離心法的68.4%，但低于5 h培養(yǎng)法的84.2%。本研究采用注射器按壓過濾法收集細菌。雙重過濾器中5 μm孔徑的上層預過濾器對尿液進行預過濾，以除去細胞、結晶等有形成分，下層可換膜式針式過濾器用于收菌細菌，過濾后直接取濾膜上細菌涂片行革蘭染色，可輔助判斷集菌情況。該集菌純化法聯(lián)合MALDI-TOF MS對單一菌生長尿液標本鑒定準確度可達92.1%，不亞于上述3種方法。此外，雙重過濾集菌純化法操作簡便、快速，2道過濾步驟一步完成，大多數(shù)尿液標本2～3 min內完成過濾集菌，標本前處理時間遠低于上述3種方法；所用過濾裝置簡單拼裝，無需特殊設備，成本也比較低。

總之，本研究探索的雙重過濾裝置純化富集尿液中病原菌的方法，具有簡單、快速、經濟且實用性強等特點，與UF1000i及MALDI-TOF MS聯(lián)合應用，可快速排除與診斷尿路感染。