1株產GES-1型碳青霉烯酶銅綠假單胞菌的全基因組測序分析*

郭慶昕，蔡加昌，周宏偉，張嶸，蔣華蔚，胡燕燕(.泉州市正骨醫院檢驗科，福建泉州362000；2.浙江大學醫學院附屬第二醫院 a.檢驗科，b.血液科，杭州30009)

銅綠假單胞菌是重要的醫院感染菌之一，可引起重癥肺炎、敗血癥、燒傷傷口感染等。產碳青霉烯酶銅綠假單胞菌(carbapenem resistantPseudomonasaeruginosa, CRPA)可水解幾乎所有可用的β-內酰胺類抗菌藥物，對全球公眾健康構成了嚴重威脅[1]。β-內酰胺酶可分A、B和D三大類，A類包括KPC、BEL、CTX-M、GES家族的成員，B類包括NDM、IMP家族和VIM家族，D類主要是OXA家族。GES類型的β-內酰胺酶在20世紀后期被發現，因其含有絲氨酸碳β-內酰胺酶的結構特征(即Cys69和Cys239之間的二硫鍵)，故與KPC型一起被分在A類中[2]。blaGES基因容易發生突變，目前已鑒定出40個亞型[3]，GES酶水解譜也不斷擴大，從原先的超廣譜β-內酰胺酶逐漸進化為碳青霉烯酶[4]。為充分闡明耐藥菌的傳播動態，本研究對1株產GES-1型碳青霉烯酶銅綠假單胞菌進行全基因測序分析，采用生物信息技術分析本菌的多位點序列分型(multisite sequencing typing, MLST)、毒力基因和耐藥基因，并分析blaGES-1基因所處的周圍環境。

1 材料與方法

1.1研究對象 研究菌株來自浙江大學醫學院附屬第二醫院重癥醫學科1例重癥肺炎患者，該患者住院期間多次發熱，曾先后使用哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉、比阿培南、左氧氟沙星等抗感染治療。該菌株于患者入ICU 13個月后從合格痰標本中分離，經基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜及微量肉湯稀釋法確定為CRPA，此后7個月中反復從痰標本中檢出。應用哌拉西林/他唑巴坦、比阿培南等抗菌藥物治療，但患者肺炎持續加重，呼吸功能衰竭，最終死亡。

1.2主要儀器與試劑 MALDI-TOF質譜儀(德國Bruker公司)，PCR擴增儀、凝膠成像系統(Bio-Rad公司)，Illumina HiSeq X10測序平臺(美國Illumina公司)，3730測序分析儀(美國ABI公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)；血瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)，銅綠假單胞菌藥敏試劑盒(珠海迪爾公司)，引物(上海生工生物公司)，dNTP mix、10×Buffer、Taq酶、加樣緩沖液(大連寶生物公司)，細菌全基因組提取試劑盒(廣州Magen公司)。

1.3細菌鑒定 標本接種于血瓊脂平板培養過夜，分離菌采用MALDI-TOF質譜進行菌種鑒定。

1.4抗菌藥物敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法檢測慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星、黏菌素、多黏菌素、頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性，以銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質控菌株，結果判讀參照據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S28標準[5]。亞胺培南和/或美羅培南的最低抑菌濃度≥8 μg/mL時判定為CRPA，頭孢哌酮/舒巴坦敏感性判讀參照CLSI-M100-S28中頭孢哌酮方案進行。

1.5全基因組測序及分析 使用細菌基因組提取試劑盒提取DNA，用TE緩沖液洗脫，用紫外分光光度計對所提取的DNA進行濃度測定，測定后的合格樣品送北京安諾優達基因科技公司，經DNA片段化、末端補平、3′端加A、連接測序接頭、PCR擴增與純化等完成文庫制備，然后采用Illumina HiSeq X10測序平臺通過雙末端150 bp測序讀長策略進行高通量測序。原始序列通過SPAdes v3.11.1[6]進行組裝，“cov-cutoff”參數選為“auto”，“phred-offset”參數選為“33”，并用RAST[7]和Prokka[8]進行注釋，Prokka軟件的“kingdom”參數選擇“Bacteria”并且選用“metagenome”參數提高基因預測能力。然后，通過Kleborate和ResFinder[9]分析菌株的MLST、毒力基因和耐藥基因，參數均采用軟件默認的設置(threshold for ID%為90%，minimum length為60%)。該銅綠假單胞菌的全基因測序原始數據已提交NCBI網站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，BioProject登記號：PRJNA648026，Biosample登記號：SAMN15616709。

1.6blaGES-1基因環境分析 全基因組測序分析顯示blaGES-1基因位于NODE_219片段中，長度3 150 bp，上游為整合子1(intl1)部分序列，下游為插入序列(ISPa21e)的部分序列。為呈現intl1和ISPa21e的完整序列，各設計了3對引物對這2個基因進行PCR擴增，引物序列見表1，產物送上海生工生物工程公司采用3730測序分析儀測序，結果用DNAMAN軟件拼接。

表1 intl1和ISPa21e擴增延伸引物

2 結果

2.1抗菌藥物敏感性試驗 根據CLSI-M100-S28判讀標準，該菌對美羅培南、黏菌素和多黏菌素B敏感，對其他抗菌藥物均為耐藥。見表2。

表2 抗菌藥物敏感性試驗結果

2.2全基因組測序結果 該菌全基因組測序分析結果顯示，測序深度75×，基因組覆蓋度100%。

2.2.1MLST及血清分型結果 經全基因組測序對7對管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE)[10]進行分析，經https:∥cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/查詢，結果為(38-11-3-13-1-2-4)，經比對，MLST分型為ST235型，血清分型為O11型。

2.2.2耐藥基因測序結果 經ResFinder數據庫比對，本株分離菌共攜帶有12個抗菌藥物耐藥基因，見表3。

表3 耐藥基因測序結果

2.2.3blaGES-1基因比對結果及基因環境 全基因組測序分析發現，blaGES-1基因位于長度為3 150 bp的 NODE_219片段中。該基因片段與GenBank中的 KY860573菌株的72068—75217一致率為99.94%。blaGES-1基因上游1—192為整合子1(intl1)部分序列；372—1235為β-內酰胺類耐藥基因blaGES-1，長度為864 bp，經ResFinder數據庫比對，與登記號為HQ170511的菌株100%一致；下游依次為：1374—1928為氨基糖苷類/氟喹諾酮類耐藥基因aac(6′)-Ⅰb3，長度為558 bp；2009—2253為無功能基因gcuE15，長度為245 bp；2261—3055為氨基糖苷類耐藥基因aph(3′)-XV，長度為795 bp；3077—3150為插入序列ISPa21e部分序列。采用PCR擴增加測序對整合子intl1和插入序列ISPa21e進一步延伸，intl1全長為1 014 bp，ISPa21e全長為1 297 bp。blaGES-1基因環境見圖1。

注：整合子1(intl1)長度1 014 bp，β-內酰胺類耐藥基因(blaGES-1 )長度為864 bp，氨基糖苷類/氟喹諾酮類耐藥基因[aac(6′)-Ⅰb3]長度為558 bp，無功能基因gcuE15長度為245 bp，氨基糖苷類耐藥基因[aph(3′)-XV]長度795 bp，插入序列ISPa21e長度為1 297 bp。

2.2.4毒力基因測序結果 全基因組測序分析共查詢到該菌包含有357個毒力基因，其中胞外酶3種，T3SS轉錄因子5種，胞外多糖20種，外毒素1種，溶血磷脂酶C 3種，溶血磷脂酶D 1種，鞭毛蛋白14種，鞭毛絲蛋白15種，菌毛蛋白25種，主要毒力基因見表4，該菌為exoU+/exoS-基因型。

表4 本菌攜帶的主要毒力基因

3 討論

銅綠假單胞菌的碳青霉烯酶編碼基因(carbapenemase-encoding genes，CEGs)并非來源于其本身，而是水平基因轉移獲得的外源基因[11]。盡管其獲得性CEGs的起源尚不清楚，但最有可能是來源于具有相同生態位的環境細菌[12]。以往認為GES酶水解碳青霉烯的能力很低，可被碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南抑制，但GES酶的獨特之處在于能通過單點突變將其水解譜擴展至碳青霉烯類[13]。

綜合全球的多項研究，發現ST235、ST175和ST111是CRPA 3個主要的高風險克隆，而ST235分布最廣，遍布全球五大洲，且ST235與O11型血清型相關[14]。Mulet等[15]研究了可能導致銅綠假單胞菌高風險克隆成功的生物標記，發現其在運動和產生色素上存在缺陷，但生物膜形成水平和自發突變頻率增加，這些特征與高風險克隆引起的慢性感染互相印證。高風險克隆的耐藥性與轉移耐藥和自發突變機制有關，其中ST235型中報道了近100個水平獲得耐藥元素，絕大多數產生金屬β-內酰胺酶或超廣譜β-內酰胺酶，其中GES酶最為多樣化[16]。

本菌基因環境分析顯示，在blaGES-1上游為Ⅰ類整合子(intl1)，下游為耐藥基因aac(6′)-Ⅰb3和aph(3′)-XV，右側翼的插入序列(ISPa21e)。有研究發現CRPA中獲得性碳青霉烯酶大多數存在于染色體位置tn402類轉座子內的Ⅰ類整合子上[17]。整合子是編碼產生整合酶，介導位點特異性重組，負責獲得或切除載有抗菌藥物耐藥基因的基因盒，多個基因片段可能被同一整合子捕獲到可變區域[18]，這解釋了本菌blaGES-1基因環境中3 150 bp的片段中集聚著3個重要的耐藥基因，對β-內酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等抗假單胞菌抗菌藥物耐藥的原因。下游為IS110家族中的插入序列ISPa21e，該插入序列屬于高度可移動性轉座因子，是對基因組一個或多個靶位點具有插入能力的小分子片段，并可以移動鄰近的基因[19]。該序列在染色體上的特定位置在不同的ST235分離株之間有所不同，表明在該克隆譜系的進化過程中發生了染色體重排[20]。在醫院環境中，非發酵革蘭陰性菌是這些元素的主要貯藏庫，當轉移到銅綠假單胞菌高風險克隆中時，會發生垂直擴增，導致CRPA的發生[21]。

經比對，本菌含有357個毒力基因，這些因子在細菌黏附、運動、生物膜形成、抗菌藥物耐藥和細胞毒性等不同環節中起作用。Ⅲ型分泌系統(T3SS)在銅綠假單胞菌生物膜形成、細胞毒作用中起重要作用，在感染過程中銅綠假單胞菌將毒素ExoS、ExoT、ExoU、ExoY注入到靶真核細胞的胞漿中，其中ExoU是一種磷脂酶效應細胞毒素，可致呼吸道、尿道、角膜和軟組織等急性上皮損傷[22]。大多數銅綠假單胞菌均可檢出ExoY和ExoT，而ExoS和ExoU則相對立，exoU-/exoS+基因型通常與侵襲表型相關，會導致宿主細胞的緩慢死亡；exoU+/exoS-基因型與細胞毒性高的菌株相關，導致宿主細胞快速而穩定的裂解，經常與慢性感染相關。高風險克隆ST235均為exoU+/exoS-基因型，與其他克隆相比，其臨床效果差，預后不良[23]。ExsA、ExsB、ExsC、ExsD、ExsE特別是ExsA，是T3SS基因表達的主要調控因子，鞭毛絲蛋白(FliC)、胞外多糖(alg)等是T3SS的其他效應子。外毒素、溶血磷脂酶C、D是重要的細胞毒素,也可導致宿主細胞裂解。

臨床早期發現高風險克隆對醫院感染控制具有重要意義，有助于避免其在醫院環境中擴散。全基因組測序在多重耐藥菌的醫院感染調查中提供基因分型、耐藥基因、毒力基因等多種重要信息，在充分闡明耐藥菌的傳播動態，了解高風險克隆成功的因素等方面發揮重要作用。