超高效液相色譜法測定穩定性肥料中雙氰胺含量的不確定度評定

黃河清，高文君，牛彥超

(上海化工研究院有限公司/上海化工院檢測有限公司 上海 200062)

氮肥施用入土后會在多種土壤微生物及其分泌的酶作用下，經歷一系列生物化學反應，從而導致其形態發生改變。未被作物吸收利用的氮素，主要以硝態氮形態流失和反硝化作用脫氮損失[1]。氮肥施用過程中，氮素以硝態氮形式大量流失，不但降低了氮肥的利用率，縮短了肥效期，而且也導致了環境污染等問題[2]。

穩定性肥料是一類添加了脲酶抑制劑和/或硝化抑制劑等增效助劑的含氮肥料，可使肥效得到延長。其中，雙氰胺(DCD)能夠通過降低氨氧化微生物中氨單加氧酶(AMO)的活性來暫時抑制硝化作用[3]，是一種常見的硝化抑制劑，適合與各種銨態氮肥或尿素配合施用。氮肥中雙氰胺的添加量不但會影響其硝化抑制作用，還會因其過量存在對農作物的生長及土壤和環境造成持續負面影響，因此需要對肥料中雙氰胺的含量進行檢測與監控。

測量不確定度是表征合理賦予被測量的值的分散性，是與測量結果相關聯的參數[4]，只有包含測量不確定度說明的測量結果才是完整的[5-6]。本文按照行業標準《肥料增效劑 雙氰胺含量的測定》(NY/T 2877—2015)[7]，采用超高效液相色譜法(UPLC)對穩定性肥料中雙氰胺的含量進行了測定，依據《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1—2012)[4]對其測定結果的不確定度進行了評定，以期為實驗室類似評定工作提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器及試劑

WATERS ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器，美國沃特世公司；AL204-1C型分析天平，METTLER TOLEDO；SHA-C型數顯水浴恒溫振蕩器，上海易友儀器有限公司；20～200 μL、100～1 000 μL移液器，Eppendorf。

雙氰胺標準物質，質量分數99.2%，CATO Research Chemicals Inc.；乙腈，色譜純，CNW Technologies；超純水。

雙氰胺標準溶液：稱取雙氰胺標準物質1.000 8 g，用水定容至100 mL，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備溶液；分別移取標準儲備溶液50、80、100、200、500 μL，用水定容至10 mL，配制成質量濃度分別為5.00、8.00、10.0、20.0、50.0 mg/L的雙氰胺系列標準溶液。

1.2 試驗條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱溫：40 ℃；流動相：超純水-乙腈(90+10)；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL；提取波長：220 nm。

1.3 試驗步驟

稱取穩定性肥料樣品約1 g于100 mL容量瓶中，加入約40 mL水，塞緊瓶塞，搖動容量瓶使樣品分散，用頻率為180 r/min的振蕩器連續振蕩30 min，取出，用水定容并搖勻，過0.22 μm水性濾膜針頭濾器，進樣測定。

按質量濃度從低到高依次進樣測定。以雙氰胺質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算得到線性回歸方程。

樣品溶液及標準溶液均重復進樣3次，超高效液相色譜法測定雙氰胺含量流程見圖1。

圖1 超高效液相色譜法測定雙氰胺含量流程

1.4 測定結果的數學模型

按式(1)計算雙氰胺質量分數：

(1)

式中：w——試樣中雙氰胺質量分數，%；

ρ——由標準曲線計算得到的試樣溶液中雙氰胺的質量濃度，mg/L；

V——試樣定容體積，mL；

m——試樣稱樣量，g。

2 不確定度來源分析

根據測量步驟及上述數學模型可知，影響UPLC法測定穩定性肥料中雙氰胺含量的不確定度的主要來源有測量重復性(A類不確定度)、標準溶液配制、最小二乘法擬合標準曲線、樣品溶液制備(天平稱量、定容體積和溫度變化)等，各來源間關系見圖2。

圖2 雙氰胺含量測定不確定度來源關系

3 結果與討論

3.1 測定結果

對上述配制的5個雙氰胺系列標準溶液分別測定3次，雙氰胺質量濃度與對應的峰面積建立的線性回歸方程為A=41 618.74ρ+11 655.24，相關系數r為0.999 9(見表1)。其中A為峰面積，ρ為質量濃度(mg/L)。

表1 雙氰胺系列標準溶液質量濃度與對應的峰面積

再對肥料樣品進行6次重復測定，測定結果見表2，雙氰胺質量分數的平均值為0.168%。

表2 穩定性肥料中雙氰胺含量測定結果

3.2 標準不確定度分量評定

3.2.1 標準溶液引入的標準不確定度u1

3.2.1.1 標準物質引入的標準不確定度u11

3.2.1.2 標準儲備溶液配制引入的標準不確定度u12

標準儲備溶液配制的不確定度來源：①天平稱量引入的不確定度；②試樣溶液定容體積引入的不確定度。

標準儲備溶液配制引入的相對標準不確定度:

3.2.1.3 雙氰胺系列標準溶液稀釋引入的標準不確定度u13

系列標準溶液稀釋引入的相對標準不確定度:

=0.005 88。

3.2.1.4 標準溶液引入的相對標準不確定度

標準溶液引入的相對標準不確定度：

=0.008 80

3.2.2 最小二乘法擬合標準曲線引入的標準不確定度u2

雙氰胺標準曲線是通過對系列標準溶液的測定值進行最小二乘法擬合得到的，擬合方程的斜率及截距的不確定度也將影響測定結果的不確定度[10-11]。

按試驗方法對試樣溶液和雙氰胺系列標準溶液分別進行3次測定，由擬合曲線求ρ0時產生的標準不確定度u2按式(2)和式(3)計算：

(2)

(3)

式中：Aj——標準溶液第j次測定所得峰面積；

a——擬合標準曲線的截距；

b——擬合標準曲線的斜率；

ρj——第j次測定的標準溶液中雙氰胺的質量濃度，mg/L；

p——樣品溶液的測定總次數；

n——標準溶液的測定總次數；

ρ0——樣品溶液中雙氰胺的質量濃度，mg/L；

ρi——標準溶液中雙氰胺質量濃度的測定值，mg/L。

UPLC法測定雙氰胺含量最小二乘法擬合標準曲線引入的相對標準不確定度：urel,2=u2/ρ0=0.009 87。

3.2.3 試樣制備過程引入的標準不確定度u3

試樣制備的不確定度來源：①天平稱量引入的不確定度；②樣品定容體積引入的不確定度。

試樣定容體積引入的標準不確定度的評定同3.2.1.2，容量瓶引入的相對標準不確定度urel(VE′)=0.000 58，溫度變化引入的相對標準不確定度urel(Vt′)=0.000 61。

樣品制備過程引入的相對標準不確定度：

3.2.4 樣品測定重復性引入的標準不確定度u4

3.2.5 合成標準不確定度

各相對標準不確定度分量統計見表3。

表3 相對標準不確定度分量一覽表

取包含因子k=2，則擴展不確定度：U=uc×k=0.005%。

穩定性肥料中雙氰胺含量可表示為：0.168%±0.005%(k=2)。

4 結語

根據NY/T 2877—2015，采用UPLC法對穩定性肥料中雙氰胺含量進行了測定。穩定性肥料中雙氰胺的測量不確定度主要來源為標準溶液和試樣測定過程中標準曲線的擬合。