金銀花離體快繁體系的建立

錢晶晶 王寧

(安徽科技學院，安徽 滁州 233100)

引言

金銀花(Lonicera japonica Thunb.)為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物，多年生纏繞木本[1]，作為我國歷史悠久的中藥材[2]，其主要有效成分為綠原酸和類黃酮等[3]，具有清熱(尤其兒童退燒)、解毒、抗氧化、增強免疫力[4,5]等功效，巨有極大的市場需求。目前金銀花的主要栽培方式為大田種植，而綠原酸等有效物質的提取又需從植物花中提取，費時費力[6]，利用組織培養技術能夠建立金銀花離體快繁體系，避免時間、空間、氣候等條件的限制[7]，提高目標化合物產率，可以更好地控制金銀花種苗質量，為金銀花藥用化學物質的商業化生產打下基礎。

本研究以金銀花莖段為外植體，建立離體快繁體系，為金銀花種苗生產，以及有益物質的簡單、快速大規模提取建立基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于安徽科技學院種植園，秋季選取生長健壯、無病蟲害、種質優良的金銀花嫩枝作為外植體。

1.2 培養條件

培養條件為溫度25±2℃，相對濕度保持在70%左右，光照2500lux，光照周期12h·d-1。

1.3 金銀花離體快繁體系的建立

1.3.1 外植體接種

選取金銀花約1cm嫩枝莖段(帶有1個腋芽)，先用清水沖洗，放在超凈工作臺中，用75%的乙醇浸泡30s，再用無菌水沖洗5遍，用0.1%HgCl2加2滴吐溫消毒9min，最后用無菌水沖洗5遍。接種到培養基內，培養35d。

1.3.2 培養基的選擇

選取MS、1/2MS、WPM、B5 4種基本培養基，每種培養基內加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調至6.5，加入1.0mg·L-1的6-BA。每種培養基作為一個處理，共4個處理，每組處理共做15個重復。將接種后的金銀花放入培養室內，培養35d，觀察金銀花組培苗增殖及植株生長情況并記錄數據，計算出平均增殖量和平均生長量。

平均不定芽增殖量(n)=不定芽增殖總量(n)/接種數(n)×100%

平均生長量(cm)=(生長總長度(cm)-接種長度)/接種數

1.3.3 培養激素的選擇

以MS培養基為基本培養基，培養基內加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調至6.5，分別加入0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1的6-BA，然后放入高壓滅菌鍋(美國，致微，GR60DA)內121℃滅菌20min。在超凈工作臺(中國，蘇州凈化，SW-CJ-1D/1G)中把金銀花莖段接入培養基內，每個莖節上都要保留1～2個腋芽。共5組處理，每組處理做15個重復。培養35d,觀察金銀花出芽數及不定芽增殖數量并記錄數據，計算不定芽誘導率和平均增殖量。

不定芽誘導率(%)=出芽數(n)/接種數(n)×100%

平均增殖量(n)=增殖總量(n)/接種數(n)

以MS培養基為基本培養基，培養基內加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調至6.0±0.2，分別加入0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1的IBA，然后放入高壓滅菌鍋(美國，致微，GR60DA)內121℃滅菌20min。在超凈工作臺(中國，蘇州凈化，SW-CJ-1D/1G)中把金銀花莖段接入培養基內，每個莖節上都要保留1～2個腋芽。共5組處理，每組處理做15個重復。培養35d，觀察生根數量，測量根長并記錄數據，計算出生根率和平均根長。

生根率(%)=生根數(n)/接種數(n)×100%

平均根長(cm)=總根長(cm)/生根總數(n)

選用MS培養基為基本培養基，培養基內加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調至6.0～6.5，分別加入NAA濃度0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1和6-BA濃度為0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1的激素配比，如表1所示，然后放入高壓滅菌鍋(美國，致微，GR60DA)內121℃滅菌20min。在超凈工作臺(中國，蘇州凈化，SW-CJ-1D/1G)中將金銀花的幼葉，切成1cm×1cm的方形，在葉片背面葉脈處用手術刀輕劃2個傷口，背面朝下接種到培養基上。共25組處理，每組處理做4個重復。培養21d后，觀察愈傷生長情況，統計愈傷誘導數、愈傷質量，計算出愈傷誘導率和增長倍數。

愈傷誘導率=愈傷誘導數/接種數×100%

愈傷誘導平均質量=愈傷誘導總量/接種數

2 結果

2.1 不同培養基對金銀花幼苗生長的影響

金銀花腋芽經過7d的培養開始生長，莖節開始膨大逐漸增高，10d左右叢生芽開始產生。由圖1可以看出，不同類型的培養基誘導幼苗平均增殖量從多至少依次為B5、MS、1/2MS、WPM,誘導幼苗平均伸長量從高至矮依次為MS、1/2MS、WPM、B5。B5培養基其大部分長出來的幼苗莖比較細且植株矮小，葉片黃綠色且蜷縮多，因此B5培養基不利于金銀花的生長。MS培養基中金銀花長勢高、葉片大且顏色翠綠。由此可得，金銀花在MS培養基中的長勢比在WPM、1/2 MS、B5 3種基礎培養基中長勢好。

表1 不同濃度激素配比情況

圖1 不同類型培養基誘導不定芽的平均增殖量和平均生長量

2.2 不同培養激素對金銀花幼苗生長的影響

2.2.1 誘導不定芽生成激素的篩選

從圖2可以看出，在同一種基礎培養基中加入不同濃度的細胞分裂素(6-BA)，使植株的成長狀況產生了很大的變化，細胞分裂素加快了細胞的分化及調節植株的生長。試驗結果表明，不定芽誘導率最高的為MS加6-BA 0.5mg·L-1，不定芽率達到93.3%，MS加6-BA 2.0mg·L-1、MS加6-BA 1.5mg·L-1和MS加6-BA 1.0mg·L-1的不定芽誘導率為85%，不加6-BA不定芽的誘導率為0。金銀花平均生芽數由多到少的培養基依次為MS加6-BA 2.0mg·L-1、MS加6-BA 1.5mg·L-1、MS加6-BA 0.5mg·L-1、MS加6-BA 1.0mg·L-1。6-BA在一定濃度范圍，不定芽的數量隨著激素濃度的升高而增加，當6-BA濃度為0.5～1.0mg·L-1時不定芽的誘導量增加，6-BA濃度在1.0～2.0mg·L-1時不定芽的誘導量逐漸減少。因此，誘導不定芽增殖的最佳6-BA濃度為1.0mg·L-1。

圖2 不同濃度激素對不定芽誘導率和平均增殖量的影響

2.2.2 生根激素的篩選

圖3 不同濃度激素對生根率和平均根長的影響

從圖3可以得出,不同濃度的IBA誘導金銀花生根的狀況不同。試驗結果表明，誘導金銀花平均生根率最高的培養基為MS加IBA 1.5mg·L-1，生根率達到80%，其次為MS加 IBA 2.0mg·L-1，生根率為53.3%。金銀花平均根長從長至短培養基依次為MS加IBA 2.0mg·L-1、MS加IBA 1.5mg·L-1、MS加IBA 1.0mg·L-1、MS加IBA 0.5mg·L-1。雖然MS加IBA 2.0mg·L-1的培養基培養出的金銀花根系最長，但根系不夠粗壯。生產中所需要的組培苗根系比較健壯、根系較多，這樣更有利于植株的成活。綜合試驗結果得出，篩選出MS加IBA 1.5mg·L-1的培養基更有利于植株生根，并且根系健壯發達，種苗成活率能夠大大提高。

3 結論與討論

組培過程中，由于植物基因型及生長特性不同，對于各種條件的需求存在著很大差異，培養基類型、植物生長調節劑、營養成分等都對植物生長有一定的影響[8]，進行針對性分析研究是非常必要的。本試驗通過對金銀花組織培養，初步建立了金銀花離體快繁及細胞懸浮培養的基本體系。

金銀花離體快繁體系的建立，最適金銀花生長的基本培養基為MS；不定芽誘導最適培養基為MS加6-BA 1.0mg·L-1；根系生長最適培養基為MS加IBA 1.5mg·L-1。與傳統繁殖方式相比，金銀花離體快繁體系的建立，提高了金銀花的繁殖系數，縮短了培育時間,為其種質資源保存、基因工程育種及推廣應用奠定基礎，同時也可促進我國優質金銀花的培育，為金銀花的工廠化快速繁殖優質種苗奠定了基礎。