生物炭稻田施用下的土壤固碳減排效應及其微生物群落結構分析

孫再慶符菁徐曉云趙遠

(1.常州市生態環境監控中心武進分中心,江蘇 常州 213000；2.常州大學環境與安全工程學院,江蘇 常州 213000)

我國是農業耕作大國，每年秸稈產量相當可觀，有大量的水稻秸稈直接被就地焚燒。秸稈焚燒生成大量溫室氣體，排放大量粉塵顆粒物，流失大量土壤有機質。將水稻秸稈制備成生物炭還田后不僅可以避免上述危害的發生，而且還可以改變土壤中細菌總量和微生物種群結構特征。

生物炭是秸稈原料在低氧高溫條件下裂解炭化制備的新型環境類功能性材料。其具有孔隙結構發達、官能團豐富、陽離子交換量和含C量較高、生物炭芳香化程度高且具有生物化學和熱穩定性等性質。不但具有改良土壤肥沃度、降低溫室氣體(CH4、CO2和N2O)排放的能力，而且具有極其優良的持續性碳封存能力，從而改變土壤生物組成。

生物炭作為摻合物混入稻田土壤后，通過對微生物的直接或間接作用，影響其生長代謝。因此，研究生物炭作為土壤基肥混入，對土壤微生物群落結構的影響意義重大。研究證明，在土壤中加入生物炭后，土壤中的細菌、真菌群落結構都發生復雜化。韓光明等發現，在菠菜土壤中添加適量生物炭后，土壤根系功能性微生物數量(根際細菌及氨化細菌、放線菌、真菌、固氮菌和反硝化細菌等)發生明顯的變化。Graber等在辣椒種植過程中摻入一定比例生物炭，對土壤中芽孢桿菌、絲狀真菌、假單胞菌等微生物的群落豐度產生影響，研究發現，生物菌群數量隨著生物炭比例增加而提升。但是，因為生物炭的添加對土壤中的生物影響非常復雜且不同的微生物需要不同特定的生長環境，所以生物炭的添加可能對原有土壤中的微生物生長沒有影響。宋延靜等通過研究在濱海鹽堿土施加不同比例生物炭后，發現生物炭添加后Ideonella和Skermanella等屬的豐度相對會增加，而對固氮螺菌屬生長沒有產生影響。

結合作物產量同溫室效應的氣體排放強度研究成為當下綜合評估農田管理措施的導向和熱點，施用不同種類的生物炭和不同量的生物炭對CH4、N2O、CO2等溫室氣體排放的影響差異性較大。劉翔等以伊犁河谷農田為研究對象，探究土壤凍融過程中N2O、CO2和CH4的排放量對生物炭的響應程度，發現生物炭的添加雖然會促進凍融土壤過程的CO2排放，但是對CH4、N2O排放的抑制作用更為明顯。Zhang等研究發現，生物炭能夠抑制N2O的排放，但是會較小程度地提高CH4的排放。

本試驗針對丹陽大田中不同施肥基質的土壤微生物群落結構和CH4、N2O、CO2氣體排放，通過高通量測序法和靜態箱-氣相色譜法，探究不同溫度條件和不同區域水稻秸稈制備的生物炭對土壤微生物群落結構和CH4、N2O、CO2氣體排放的影響，對于固體廢棄物再利用以及固碳減排的研究有重大意義。

1 材料與方法

1.1 試驗地與試驗材料

本試驗水稻田位于丹陽市珥陵鎮，具體位置為E119.598452°，N31.86952°。珥陵鎮具有得天獨厚的地理位置，屬于亞熱帶季風氣候，春季和秋季為冬、夏季風的轉換季節，冷暖氣團相互交織，導致寒暑干濕差異性顯著。

本試驗中設計的收割后秸稈生物炭制備方式：將收割的水稻秸稈放置在干燥的環境中自然風干；將風干后的水稻秸稈切割成小段，放入多功能粉碎機(轉速為3萬r·min-1)，分成4步粉碎(時間為30s、30s、90s、30s)；用100目篩子將粉碎后的秸稈過篩，并裝入30mL的坩堝中壓實(將顆粒之間的空氣擠出)；坩堝放入馬弗爐中，在500℃條件下炭化120min。炭化后得到2種秸稈生物炭，將300℃、700℃條件下制備的生物炭分別標注為DY-300、DY-700，生物炭的理化性質見表1。本試驗使用的秸稈生物炭均未經過活化，直接施入土壤中。

表1 不同溫度下制備的秸稈生物炭的理化性質

1.2 試驗設計

本課題針對丹陽大田，將生物炭作為外源性基質添加進土壤中，研究水稻秸稈經過不同溫度炭化處理后，土壤微生物群落結構和物種豐度的變化，同時針對水稻不同生長時期CH4、N2O、CO2排放通量的變化規律進行分析。具體分組如表2所示。

試驗為田間小區試驗，前茬作物為小麥。采用隨機區組設計，設置施用生物炭DY-0、DY-300和DY-700共3個處理。6月上旬播種，7月上旬施用生物炭，7月中旬移栽，分蘗期7月28日采集土壤樣品和氣體樣品，8月13日采集氣體樣品，抽穗期8月28日采集土壤樣品和氣體樣品，9月19日采集氣體樣品，成熟期10月12日采集土壤樣品和氣體樣品。土壤樣品可短期保存于-20℃冰箱，或者長期儲存于-80℃超低溫冰箱；氣體樣品可常溫常壓儲存在鋁箔采樣袋，需盡快送樣檢測。

表2 丹陽實驗大田分組表

1.3 土壤CO2、CH4和N2O排放通量測定

本試驗中土壤溫室氣體的采集方式是靜態箱，測定方式是氣相色譜法。靜態箱-氣相色譜法聯用是田間溫室氣體測定的常用方法。

依據箱內氣體濃度變化率計算土壤溫室氣體排放通量，計算公式：

(1)

式中，F為溫室氣體通量，mg·(m-2·h-1)或μg·(m-2·h-1)；ρ為標準狀態下溫室氣體質量濃度，kg·m-3；V為靜態箱體積，m3；A為靜態箱水平面面積，m2；dc、dt為溫室氣體排放速率，mL·(m-3·h-1)；T為采樣箱內氣體溫度，℃；T0為0℃對應的熱力學溫度值。

依據排放通量計算土壤溫室氣體累積排放通量[14]，計算公式：

(2)

式中，CE為氣體累積排放量，mg·m-2；F為氣體排放通量，mg·(m-2·h-1)；i為第i次氣體采樣；ti+1-ti為2個相鄰測定日期的間隔，d；n為累積排放量觀測時間內總測定次數。

1.4 土壤微生物高通量測序

1.4.1 土壤樣品采集

在DY試驗大田中，考慮到每組試驗田的面積較小且形狀規整，因此本次采樣選用對角線法，單組試驗田共設置5個點，每個點采集地下0～10cm表層土壤200g左右，將混勻后的水稻田土樣裝入無菌塑封袋中，擠出袋內多余的空氣，貼上標簽。-20℃冰箱保存待用(短期保存)。

1.4.2 微生物DNA抽提、擴增及測序

通過強力土壤DNA提取試劑盒抽提水稻田環境中高品質的總DNA(條帶長度：15000bp)，再按照PCR擴增儀(2720PCR+)提供的試驗流程進行，引物由宏眾基因公司提供，其中PCR正向引物序列為6’—AYTGGGYDTAAAGNG—3；PCR反向引物序列為6’—TACNVGGGTATCTAATCC—3’。經過16S rRNA擴增(條帶長度：400bp)，最后進行建庫測序，測定土壤中細菌界微生物。采用瓊脂糖凝膠電泳試驗對提取的長鏈DNA和PCR反應的短鏈DNA進行定性分析，作為測序工作繼續進行的依據。

1.5 秸稈生物炭理化性質的測定

1.5.1 秸稈生物炭制備

水稻秸稈收集后，風干5d，洗凈，經多功能高速粉碎機切割后，過100目篩，置于30mL陶瓷坩堝中，將秸稈壓實后蓋上蓋，再將其置于馬弗爐內，以15℃·min-1的升溫速度分別升溫至300℃、700℃，保溫3h，自然無氧冷卻至室溫。取出后研磨，過100目篩，密封干燥保存。

1.5.2 秸稈生物炭表征

生物炭的產率采用重量法計算；pH值利用pH計(FE28，中國，梅特勒-托利多)測定，方法參照GB/T 12496.7—1999標準；污泥生物炭比表面積(BET)采用物理吸附儀(Autosorb-iQ2-MP)進行測試，方法參考Joyner L G等研究方法；采用掃描電鏡(SEM)儀(JEOIJSM-6360LV)進行表面形貌分，方法參照苗壯等研究方法。

2 結果與分析

通過上述步驟得出的結果進行分析，生物炭基肥理化性質分析、溫室氣體排放通量分析、瓊脂糖凝膠電泳圖分析、微生物群落多樣性分析、土壤微生物群落結構與溫室氣體排放的相關性分析，具體分析如下。

2.1 生物炭基肥理化性質分析

生物炭作為一種外源性基肥，其多孔性和顆粒結構對土壤物理結構和化學性質有直接和間接影響，本試驗通過馬弗爐炭化水稻秸稈制得生物炭基肥，并對其理化性質進行分析。具體分析結果如表3、圖1所示。

如表3所示，700℃條件下生物炭中的含C量高于300℃條件下生物炭，高出31.6%。2種條件下制備的生物炭的比表面積具有顯著差異，兩者的比表面積差異高達27倍，700℃高溫條件下使得羥基、烴基、芳香烴環先后發生裂解，產生大量的揮發性氣體，氣體的釋放沖擊生物炭表面使得孔隙的張開，形成豐富的孔徑結構，從而致使比表面積的增加。通過分析圖1中DY-300和DY-700結果表明，相比300℃條件下制備的生物炭，700℃的微孔數量密集、孔隙率高、表面形狀規整、分層現象明顯、出現少量晶面，說明在700℃下生物炭基肥的理化性質優于300℃下。

表3 生物炭基肥理化性質

圖1 生物炭的電鏡掃描

2.2 溫室氣體排放通量分析

在DY實驗大田中，用靜態箱-氣相色譜法測定水稻生長過程中土壤CH4、N2O、CO2濃度，分析水稻秸稈在不同溫度條件下制備的生物炭對水稻生長過程中土壤CH4、N2O、CO2氣體排放通量和累計排放量的影響，并比較水稻不同生長時期CH4、N2O、CO2氣體排放的差異性。

將采樣氣體濃度同標準樣品校核后，計算出一定間隔情況下氣體濃度的差值，并帶入公式(1)和公式(2)求出不同氣體在不同時期的排放通量和累積排放量，具體排放通量和累積排放量分析如圖2至圖5所示。

觀察CH4、N2O、CO23種氣體在不同時期的排放通量以及不同處理后氣體累積排放量的差異。

由圖2可知，在生物炭添加進土壤的初期，由于生物炭多孔和富含有機質的特性，使土壤的孔隙度和有機質增加，致使微生物的有氧呼吸作用加強，在DY-300和DY-700的處理中明顯CO2的排放通量顯著高于DY-0的處理。隨著微生物反應和生物炭礦化作用，經過生物炭處理的樣品CO2排放的優勢趨于顯著。處理中期，由于生物炭的優良性狀，促使DY-300和DY-700樣品的CO2排放量明顯低于DY-0的樣品。水稻生長的后期，由于生物炭的綜合性作用逐漸減弱，對于稻田微生物的優勢性作用緩慢減弱，土壤中CO2的排放在DY-0、DY-300和DY-700處理之間趨于穩定。

圖2 不同時期CO2氣體排放通量

圖3 不同時期N2O氣體排放通量

由圖3可知，在水稻生長的前期，DY-0處理中土壤含氧量低，微生物進行反硝化過程，將硝酸鹽或者硝態氮還原成氮氧化物(N2O、NO等)和氮氣。因此，水稻生長前期N2O排放通量>水稻生長中后期N2O排放通量；未經生物炭處理的水稻田土壤N2O排放通量>經過生物炭處理后的N2O排放通量。基于生物炭基肥水稻田土壤的N2O排放抑制性能為DY-300>DY-700>DY-0。生物炭對N2O排放的影響既是直接作用又是間接性作用。生物炭通過改變土壤的pH值、土壤的有機質含量、土壤的孔隙度、土壤的含水率等性質間接對N2O排放通量產生影響。

圖4 不同時期CH4氣體排放通量

由圖4可知，在水稻生長前期，CH4排放通量為DY-0>DY-700>DY-300，土壤淹水其還原電位降低，甲烷促生菌大量生成，甲烷的排放量顯著提升。水稻田曬田期間，土壤中含水量降低，與空氣的氣體交換加強，甲烷促生菌產甲烷受到抑制，也可能是由于季節性變化導致CH4排放通量整體下降。由圖4得知，水稻生長前期土壤中CH4氣體排放量顯著高于水稻生長后期。

圖5 不同生物炭處理氣體累積排放量

由圖5可知，水稻田土壤氣體排放規律：CO2累積排放量，2種生物炭處理(DY-300、DY-700)后，土壤CO2累積排放量與對照組(DY-0)基本保持一致，并無顯著差異；N2O累積排放量，DY-0>DY-700>DY-300，DY-300處理組的氮抑制性能最優；CH4累積排放量，DY-0>DY-700>DY-300,DY-300處理組的甲烷抑制性能最優。

2.3 微生物群落多樣性分析

丹陽實驗大田中采集到水稻土壤，選擇通用引物，以16S rRNA基因為標靶，通過高通量測序分析土壤微生物群落，研究在不同溫度條件制備的水稻秸稈生物炭對土壤微生物的群落結構的影響，水稻生長的不同時期對土壤微生物的群落結構的影響。

2.3.1 微生物豐度與多樣性指數分析

土壤樣品DNA高通量分析，選用Alpha多樣性分析，統計結果如表4所示。

表4 Alpha(PD-whole-tree、observed-otus)多樣性統計

如表4、圖6、圖7所示，不同條件生物炭處理對土壤微生物多樣性指數的作用差異性是不同的。從PD-whole-tree指數分析，水稻生長前期多樣性比較為PD whole tree(DY-700-1)>PD whole tree(DY-300-1)>PD whole tree(DY-0-1)；水稻生長中期多樣性比較為PD whole tree(DY-300-1)>PD whole tree(DY-0-1)>PD whole tree(DY-700-1)；水稻生長期多樣性比較為PD whole tree(DY-700-1)>PD whole tree(DY-300-1)>PD whole tree(DY-0-1)。從Observed OTUs指數分析，分析結果同PDwholetree指數分析比較，在水稻生長前期Observed OTUs(DY-300-1)>Observed OTUs(DY-700-1)>Observed OTUs(DY-0-1)。Shannon指數分析結果同PD-whole-tree指數分析分析結果相似。由于不同多樣性指數算法存在差異，所以不同自變量組之間的多樣性指數是具有一定差異的。從chao1指數看，探究同一時期物種豐度，水稻生長前期和后期均為Chao1(DY-700)>Chao1(DY-300)>Chao1(DY-0)，水稻生長中期為Chao1(DY-300)>Chao1(DY-700)>Chao1(DY-0)。上述圖表均表明，生物炭的添加有效提高了種群多樣性和豐度，在水稻不同生長時期作用具有差異性。

圖6水稻不同生長時期chao1指數分析

圖7 水稻不同生長時期Shannon指數分析

2.3.2 微生物相對豐度分析

如圖8所示，土壤中微生物浮霉菌門(Planctomycetes)豐度差異較小，為2.3%±0.2%。變形菌門(Proteobacteria)是測序微生物中的優勢菌種，相對豐度值為40.7%～55.2%，其性狀表現為水稻種植前期不同處理的優勢度DY0-1>DY700-1>DY300-1、種植中期樣本間優勢度DY700-2>DY300-2>DY0-2、種植后期樣本間優勢度DY0-3>DY300-3>DY700-3；硝化螺旋菌門(Nitrospirae)作為硝化細菌的大類，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，是土壤中氮循環的重要成員，相對豐度值為1.7%～8.9%，水稻生長前期硝化螺旋菌門豐度DY300-1>DY700-1>DY0-1、水稻生長中期相對豐度DY-0-2>DY300-2>DY700-2、水稻生長后期相對豐度DY300-3>DY700-3>DY0-3，且水稻水稻生長后期硝化螺旋菌門的種群相對豐度明顯高于前中期。不同生物炭處理，不同時期的水稻微生物Phylum水平相對豐度是明顯發生改變的，同一時期增添生物炭的水稻田微生物群落結構具有相對優勢。

圖8 土壤微生物相對豐度

圖9 Phylum水平物種豐度熱圖

圖10 Phylum水平物種的聚類分析

如圖10所示，土壤樣品中細菌微生物豐度Phylum水平(除變形菌門外)前30個進行分層聚類分析。聚類結果表明，DY300-2、DY700-3和DY0-1土壤樣品集聚在一起，DY300-1、DY700-1土壤樣品集聚在一起，DY0-2、DY0-3和DY700-3集聚在一起。生物炭的增添為水稻田原著微生物和菌落生存提供了有利條件，這種優良的環境條件致使土壤微生物的種類和豐度發生改變，從而改變了不同時期、不同處理的土壤微生物聚類。

2.4 土壤微生物群落結構與溫室氣體排放的相關性分析

在DY實驗大田中，經過不同溫度條件炭化的生物炭處理后，土壤微生物群落結構產生不同的響應。分析在不同土壤微生物群落結構與CH4、N2O、CO2排放通量量變化關系。通過IBM SPSS Statistics 20軟件分析溫室氣體排放量和微生物兩者之間的相關性。

2.4.1 溫室氣體排放與細菌Phylum水平相對豐度的關系

下述分析中細菌Phylum物種水平相對豐度均高于0.3%。

將CO2排放通量與細菌門類相對豐度進行相關性分析，如表5所示。CO2排放通量與衣原體門相對豐度呈顯著負相關(p<0.05)；CO2排放通量與OD1門相對豐度呈顯著負相關(p<0.05)；CO2排放通量與浮霉菌門、螺旋體門相對豐度呈顯著正相關(p<0.05)；OD1門為基因在NCBI庫中未檢索到。此外，經研究發現部分的CO2排放可能來源于水稻作物的呼吸作用。

表5 CO2排放通量與細菌Phylum水平物種相關性

表6 N2O排放通量與細菌Phylum水平物種相關性

將N2O排放通量與細菌門類相對豐度進行相關性分析，如表6所示。N2O排放通量與FCPU426門相對豐度呈顯著正相關(p<0.05)；N2O排放通量與SC4門相對豐度呈顯著負相關(p<0.05)。FCPU426門、SC4門為基因序列在NCBI基因庫中未檢索到對應的細菌門。

表7 CH4排放通量與細菌Phylum水平物種的相關性

將CH4排放通量與細菌門類相對豐度進行相關性分析，如表7所示。CH4排放通量與硝化螺旋菌門、OD1門相對豐度呈顯著負相關(p<0.05)。

2.4.2 溫室氣體排放與細菌Genus水平相對豐度的關系

下述分析中細菌的Genus物種水平相對豐度均高于0.1%。

表8 CO2排放通量與Genus水平物種相關性

將CO2排放通量與細菌屬類相對豐度進行相關性分析，如表8所示。CO2排放通量與甲基單胞菌屬、棍衣原體屬呈顯著正相關性(p<0.05)；CO2排放通量與紫色非硫細菌呈高度負相關性(p<0.05)。

表9 N2O排放通量與Genus水平物種相關性

將N2O排放通量與細菌屬類相對豐度進行相關性分析，如表9所示。N2O排放通量與泉發菌屬、甲基球菌屬呈高度正相關性(p<0.05)；N2O排放通量與甲基單胞菌屬、甲基彎曲菌屬呈顯著正相關性(p<0.05)；N2O排放通量與紫色非硫細菌呈顯著負相關性(p<0.05)。

表10 CH4排放通量與Genus水平物種相關性

將CH4排放通量與細菌屬類相對豐度進行相關性分析，如表10所示。CH4排放通量與泉發菌屬、甲基球菌、甲基桿菌屬、地發菌屬呈顯著正相關性(p<0.05)；CH4排放通量與甲基單胞菌屬呈高度正相關性(p<0.05)；CH4排放通量與紫色非硫細菌呈高度負相關性(p<0.05)；CH4排放通量與脫硫桿菌屬呈顯著負相關性(p<0.05)。

甲基球菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬3種菌屬都與CH4排放通量呈正相關性。由于上述3種菌屬菌是以短鏈有機碳(甲烷、甲醇、甲醛等)作為生命質C源，因此土壤中甲基球菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬的相對豐度可以表征土壤中CH4排放濃度，但是這種表征方式時效性差，具有一定的延遲性。甲基球菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬之間屬于競爭關系。

甲基單胞菌屬、紫色非硫細菌、泉發細菌屬和甲基球菌屬4種菌與CH4、N2O、CO2排放通量之間的聯系緊密。其中，甲基單胞菌屬、甲基球菌屬為異養性微生物，呼吸作用排放CO2，兩者均是以CH4作為有機碳源，因此當CH4長期高濃度排放時，甲基單胞菌屬、甲基球菌屬的相對豐度會上升，此外，2種菌屬與N2O排放量呈正相關性，說明這2種菌屬在生命活動過程中釋放N2O。而紫色非硫細菌為自養型微生物，能進行光合作用，固定CO2，從CH4角度分析，可能是CH4的存在對該菌種的生長產生了抑制作用。泉發菌屬為兼性自養型微生物，其相對豐度同CH4、CO2呈正相關性，由于其本身的性質，本試驗無法確定是高濃度的CH4、CO2排放導致泉發菌屬相對豐度增加，還是泉發菌屬相對豐度上升導致了CH4、CO2排放的增加，因此還需進一步試驗進行驗證。

3 討論

3.1 生物炭的增添可抑制水稻田N2O、CH4排放，但對CO2排放作用不明顯

DY水稻田間添加生物炭基肥和未添加生物炭基肥對水稻田中N2O、CH4氣體的累積排放具有顯著的差異性。從N2O排放通量上來看，水稻生長前期，DY0-1處理排放量是DY300-1處理排放量的18.3倍；水稻生長中期，DY0-1處理排放量是DY300-1處理排放量的5.0倍；水稻生長后期，DY0-1處理排放量是DY300-1處理排放量的1.5倍。DY0-1同DY700-1處理組之間的N2O排放通量差異性相對較小。CH4累積排放量在未經處理和經生物炭處理后并無顯著性差異。

3.2 生物炭的增添可提高土壤微生物的多樣性，在不同時期顯現的功能性不同

DY水稻田中經過生物炭處理后的生物群落多樣性顯著高于未經生物炭處理的樣本，在水稻生長前期和后期群落多樣性呈現DY700>DY300>DY0，而在水稻生長中期群落多樣性呈現DY300>DY700>DY0。從時間上分析，水稻生長前期和后期的群落多樣性明顯高于生長中期的多樣性。從相對豐度上分析，變形菌門、綠屈撓菌屬、酸桿菌門在水稻田土壤中表現為優勢菌門，其優勢度分布為變形菌門>酸桿菌門>綠屈撓菌屬。

3.3 甲基單胞菌屬、紫色非硫細菌、泉發細菌屬和甲基球菌屬相對豐度對溫室氣體排放的具有顯著相關性

DY水稻實驗田中CO2、CH4、N2O排放通量與甲基單胞菌屬、泉發菌屬、甲基球菌、甲基彎曲菌屬、紫色非硫細菌、甲基桿菌屬、脫硫桿菌屬、地發菌屬、棍衣原體的相對豐度呈相關性。甲基單胞菌屬豐度與3種氣體的排放均呈正相關性；紫色非硫細菌豐度與3種氣體的排放均呈負相關性；泉發細菌屬豐度與CH4、N2O排放通量呈正相關性；甲基球菌豐度與CH4、N2O排放通量呈正相關性。甲基單胞菌屬、紫色非硫細菌、泉發細菌屬和甲基球菌豐度對土壤溫室氣體排放具有相對直接的影響作用。