沙苑子中抗氧化活性物質的提取工藝研究

王 新，蔣彩云，李玲玲，劉海浪，馮鑫葦

(江蘇經貿職業技術學院 健康學院，江蘇 南京 211168)

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪的干燥成熟種子，主要含有沙苑子甙、沙苑子新甙、沙苑子楊梅甙、紫云英甙、山柰素，以及多肽、蛋白質、酚類等成分。作為傳統中藥，其性溫味甘，歸肝、腎經，具有溫補肝腎、降壓降脂、利尿澀精等功效[1-2]，可用于治療肝腎虧虛、白濁帶下、頭暈目眩等癥。

于猛等人通過計算機模擬的方法，初步探討了沙苑子苷A潛在的抗腫瘤靶點，并采用CDOCKER進行分子對接初步驗證。結果表明，沙苑子苷A可調控原癌基因酪氨酸蛋白激酶以及蛋白纖維生長的受體，從而進一步得出沙苑子苷A確實能夠調控血管生長的相關靶點，可能是抗腫瘤作用的主要活性成分[3]。現代藥理研究表明，沙苑子具有抗疲勞、延緩機體衰老等保健功能。同時，沙苑子及其復方制劑也可以通過增強細胞免疫和非特異性免疫的方式發揮抗炎、抗癌的功效[4-5]。研究發現，沙苑子的化學成分主要包括黃酮類、三萜皂苷類、脂肪酸、氨基酸、多糖等[6-7]。其中，沙苑子總黃酮具有較強的抗癌、抗氧化能力[8-9]，是沙苑子發揮藥理作用的主要成分。

本文選用的標準參照物為維生素C，結合單因素考察法和正交試驗法，分析沙苑子中抗氧化活性物質的提取工藝，并進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

沙苑子(安徽省亳州市雙華中藥飲片廠)、無水乙醇、1,3-丁二醇、甲醇、1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、維生素C，實驗用水皆為去離子純凈水。

1.1.2 設備

HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州金壇宏華儀器廠；DR2800型紫外分光光度計：上海坤權生物科技有限公司；BS223S型電子天平：瑞士Mettler公司；電熱鼓風干燥箱：華飛電熱設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙苑子中活性成分的提取

稱取沙苑子藥材，放入烘箱烘干至恒重，放入粉碎機進行研磨粉碎，然后過篩。準備等體積的不同提取劑，分別稱取沙苑子粉末1.0 g置于提取劑中，設定不同的提取條件，得到相應含沙苑子抗氧化成分的提取液。

1.2.2 DPPH法評價沙苑子提取液的抗氧化性

1.2.2.1 配制DPPH溶液

取39.0 mg 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，加入無水乙醇使其充分溶解，定容，配制濃度為0.1 mmoL/L 的DPPH溶液，將其移至棕色試劑瓶中，避光貯存，備用。

1.2.2.2 DPPH清除率的計算方法

空樣溶液：取0.1 mmoL/L的DPPH溶液10 mL，加入比色管。

反應溶液：取5 mL沙苑子提取液和5 mL DPPH溶液，加入比色管。

空白溶液：取10 mL空白溶劑，加入比色管。

將上述溶液置于超聲波中進行充分混合，避光反應半個小時。使用分光光度計，設定波長為517 nm，分別測定吸光度值(Abs)，即A空樣液，A反應液，A空白液。

DPPH清除率(%)=[A空樣液-(A反應液-A空白液)/A空樣液]×100%

1.2.3 DPPH法評價維生素C的抗氧化性

1.2.3.1 配制維生素C標準溶液

取12.5 mg維生素C粉末，置于50 mL燒杯中，加入少量純凈水使其完全溶解，移至500 mL容量瓶中定容，配制成0.025 mg/mL的維生素C溶液。分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL維生素C溶液于10 mL比色管中逐級稀釋，定容至10 mL。維生素C標準溶液的濃度分別為0.0015、0.0020、0.0025、0.0030、0.0035、0.0040、0.0045、0.0050 mg/mL。

1.2.3.2 制作維生素C標準曲線

按照1.2.2.2中的操作步驟，將反應溶液改為5 mL不同濃度的維生素C標準溶液，使用分光光度計，設定波長為517 nm，分別測定吸光度值，得出DPPH清除率的對應值。

1.2.4 每克沙苑子樣品中抗氧化成分相當于維生素C的含量測定

取1.0 g沙苑子樣品，在最佳提取條件下，測定所得提取液的DPPH清除率，再根據維生素C濃度與DPPH清除率的線性方程，計算每克沙苑子樣品中含有的抗氧化成分相對于維生素C的當量。

2 結果與分析

2.1 維生素C標準溶液的抗氧化性

采用評價自由基清除效果和挑選天然抗氧化劑最常用的方法——DPPH分光光度法，測定已知標準濃度的維生素C的抗氧化性。以維生素C濃度為橫坐標、DPPH清除率為縱坐標，建立標準曲線(見圖1)。兩者之間符合線性關系，得到線性方程y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)。根據線性方程，構建評價體系，測定單位沙苑子中抗氧化活性成分相對于維生素C的當量。

圖1 VC濃度與DPPH清除率的標準曲線

2.2 因素水平的有效選擇

2.2.1 提取溶劑對抗氧化物提取效果的影響

分別選用無水乙醇、75%乙醇、純水、甲醇、1，3-丁二醇為提取溶劑，40 ℃加熱，攪拌30 min，過濾，得到相應的提取液，計算各提取液的DPPH清除率。從圖2可以看出，以75%乙醇為提取溶劑時，抗氧化物提取效果最佳，純水次之。

圖2 不同提取溶劑對DPPH清除率的影響

2.2.2 提取溶劑濃度對抗氧化物提取效果的影響

分別取濃度40%、50%、60%、70%、75%、80%的乙醇，40 ℃水浴加熱30 min，抽濾，得到相應的提取液，測定提取液的抗氧化能力。從圖3可以看出，50%乙醇的抗氧化物提取效果最佳。

圖3 不同提取溶劑濃度對DPPH清除率的影響

2.2.3 料液比對抗氧化物提取效果的影響

選用50%乙醇，40 ℃條件下提取30 min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，測定提取液的抗氧化能力。由圖4可以看出，最佳料液比為1∶30。

圖4 不同料液比對DPPH清除率的影響

2.2.4 提取溫度對抗氧化物提取效果的影響

選用50%乙醇，提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，提取時間30 min，測定提取液的抗氧化能力。從圖5可以看出，DPPH清除率隨溫度升高而升高。但是實驗過程中需要考慮溫度過高容易導致溶劑量的損失及抗氧化物失活，因此，提取溫度選定70 ℃。

圖5 提取溫度對DPPH清除率的影響

2.2.5 提取時間對抗氧化物提取效果的影響

選用50%乙醇，提取溫度40 ℃，分別提取20、30、40、50、60 min，測定提取液的抗氧化能力。從圖6可以看出，提取30 min時，DPPH清除效果最佳。

圖6 不同提取時間對DPPH清除率的影響

2.3 正交試驗設計

根據單因素實驗結果，設計L20(44)正交試驗，因素水平見表1，試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

從表2可知，各因素對沙苑子活性成分提取效果的影響順序為料液比>提取溫度>提取溶劑濃度>提取時間。得出最佳提取工藝條件：45%乙醇、料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取時間30 min。

根據最佳提取工藝條件，精確量取1.0 g沙苑子粉末，加入32 mL 45%乙醇，70 ℃水浴加熱，攪拌30 min，得到提取液，稀釋后測定沙苑子提取物的DPPH清除率。平行實驗三次，測定結果分別為：72.1%、73.0%、72.3%，得出抗氧化率的平均值為72.5%。

2.4 每克沙苑子樣品中抗氧化成分相當于維生素C的含量

根據2.3最佳提取條件得到的平均抗氧化率為72.5%，由維生素C溶液與DPPH溶液的標準曲線方程：y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)，計算出單位質量沙苑子樣品中抗氧化成分相當于維生素C的含量為46.2 mg。

3 結論

采用單因素實驗結合正交試驗的方法，考察提取溶劑濃度、提取溫度、提取時間、料液比等因素對沙苑子中抗氧化活性物質提取效果的影響。選用維生素C作為標準參照物，對沙苑子中抗氧化活性物質提取工藝條件進行了優化。確定沙苑子中抗氧化活性物質的最佳提取工藝條件：料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取溶劑45%乙醇、提取時間30 min。