獨角蓮抗腫瘤活性成分初步研究

寧停波，李濤，姜宇珺，梁紅寶，姚景春，張貴民*（.山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂73400；.魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 76006）

獨角蓮為天南星科犁頭尖屬植物獨角蓮（Typhonium giganteumEngl.）的干燥地下塊莖，現主產于河南、甘肅等地區[1]，在中國有著悠久的藥用歷史，具有逐寒、祛風痰、止痛止痙、解毒散結之功效，臨床上常用來治療驚風癲癇、破傷風等癥，民間也用于治療惡瘡、毒蛇咬傷[2]。近年對獨角蓮的研究主要集中在其抗惡性腫瘤活性方面，且藥理學實驗也證實獨角蓮具有顯著的抑制腫瘤生長作用[3-6]，但其相關的活性成分卻一直沒有確定[7]。之前該植物化學成分研究主要集中于脂溶性部位，分離得到的化合物主要有腦苷類、有機酸、氨基酸等成分[8-10]?；讵毥巧彽乃嵛锞哂休^好活性[11]，而且該部位化學成分的研究報道很少，所以本文采用活性追蹤法利用模式動物對獨角蓮的水提物進行抗腫瘤活性的初步研究。

1 材料

Bruker-600 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；6500Serises Q-TOF質譜儀（美國Aglient公司）；半制備型高效液相色譜儀輸液泵（NP7010）、檢測器（NU3001）（漢邦科技）和色譜柱（50 mm×200 mm，北京創新通恒科技有限公司）；001×7陽離子交換樹脂和201×4陰離子交換樹脂（天津南開化工廠）；薄層硅膠色譜（青島海洋化工廠）；步琪R3旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；切片機（上海南掘中藥機械制造有限公司，QYJ-200）；烘干機（上?？到≈兴帣C械制造有限公司，FYJ-8）；粉碎機（上海市藥材藥材有限公司，FY320）；離心機（上海戴寶機械設備有限公司，GQ142）；L-精氨酸對照品（深圳市斯坦德化工科技有限公司，純度≥98%）；其他試劑均為分析純；ICR小鼠4～6周，雌雄各半，體質量18～22 g [北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證：SCXK（京）2016-0011]；S180小鼠腹水瘤細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）；獨角蓮購自黑龍江省七臺河，經魯南制藥集團中藥制藥共性技術國家重點實驗室李守信高級工程師鑒定為獨角蓮Typhonium giganteumEngl.的塊莖，植物標本存放于魯南制藥集團中藥制藥共性技術國家重點實驗室。

2 提取與分離

取鮮獨角蓮塊莖（50.0 kg）切片、烘干、粉碎，過40目篩，加入10倍量水加熱至微沸提取3次，每次提取2 h，合并提取液，加入95%乙醇調節醇濃度至30%，醇沉過夜，離心取上清液，減壓濃縮得總浸膏2.2 kg。將總浸膏溶解于純化水中，上樣預處理好的001×7陽離子交換樹脂柱（15 kg，13 mm×1400 mm），吸附過夜，收集上樣流出液，蒸干得組分Fr.1（1.8 kg）；用純化水沖洗樹脂柱至無色，再用0.5%的氨水洗脫樹脂至無色，收集洗脫液，減壓濃縮至干膏，即得獨角蓮水提液的活性部位Fr.2（103.1 g）。Fr.2用純化水溶解，上樣預處理好的201×4陰離子交換樹脂柱（15 kg，13 mm×1400 mm），吸附過夜，收集上樣流出液，蒸干得組分Fr.3（63.7 g）；用純化水沖洗樹脂柱至無色，再用0.1%的鹽酸洗脫樹脂至無色，收集洗脫液，減壓濃縮得干膏Fr.4（18.3 g）。Fr.4經半制備高效液相色譜分離，甲醇-水（5∶95）為流動相，檢測波長220 nm，純化得化合物1（198.3 mg，流速1 mL·min－1，tR＝3.715 min）。

3 結構鑒定

化合物1：白色結晶，mp 244℃；1H NMR（600 MHz，D2O）δ：1.59（1H，m，H-2），1.80（1H，d，H-5），3.27（1H，t，H-6）；13C NMR（150 MHz，D2O）δ：157.67（C-1），40.39（C-2），23.78（C-3），28.48（C-4），54.22（C-5），179.38（C-6）；ESI-MS：m/z175.1 [M＋H]－。以上數據與文獻報道一致[12]，在相同TLC、HPLC條件下，化合物1與L-精氨酸對照品的Rf值、顯色情況以及出峰時間完全一致，故鑒定化合物1為L-精氨酸。

4 對小鼠S180實體瘤抑制活性

4.1 對小鼠S180實體瘤的體內抑瘤活性檢測

體外培養S180細胞，調節細胞濃度為1×107個·mL－1，取0.2 mL接種于備用小鼠的腹腔，形成腹水，按以下方法傳代：脫頸處死荷瘤小鼠，放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡5～10 min，將消毒后的小鼠放入超凈工作臺中，暴露腹部，無菌條件下，抽取小鼠腹水，1000 r·min－1離心5 min，生理鹽水清洗5遍，去除蛋白等雜質，用生理鹽水調節細胞濃度為1×107個·mL－1，0.2 mL接種于備用小鼠的腹腔，待生成腹水后重復傳代步驟。取2～3代狀態良好的乳白色腹水離心后，生理鹽水調節細胞濃度為5×106個·mL－1，每只0.2 mL接種于實驗小鼠腋下。

將上述已造模的小鼠按體質量隨機分為21組，每組10只，分別為：模型組和不同劑量給藥組；給藥組組分Fr.1、Fr.2按表1所列劑量給藥，組分Fr.3、Fr.4按表2所列劑量給藥，化合物1、L-精氨酸按表3所列劑量給藥。按實驗設計劑量灌胃給藥，模型組給予等體積純化水，1次·d－1，連續10 d。分組后連續給藥，待模型組腫瘤直徑長至1.2～1.5 cm停藥，麻醉放血，剖檢小鼠，稱取小鼠腫瘤質量。抑瘤率＝（模型組瘤質量－用藥組瘤質量）/模型組瘤質量×100%。應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，實驗數據以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

4.2 獨角蓮水提液活性部位的抑瘤活性

由表1可知，組分Fr.2中、高劑量均能顯著抑制小鼠S180實體瘤的生長，抑瘤率分別為48.15%和53.70%，而組分Fr.1（001樹脂上樣流出液）不具有抑瘤活性或活性很低。

表1 組分Fr.1和Fr.2對小鼠S180實體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 1 Anti-tumor effect of Fr.1 and Fr.2 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

表1 組分Fr.1和Fr.2對小鼠S180實體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 1 Anti-tumor effect of Fr.1 and Fr.2 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05（Compared with the model group，*P＜0.05）。

組別劑量/（g·kg－1）瘤質量/g抑瘤率/%模型組－1.62±0.26－Fr.1不同劑量組21.32±0.31－3.14 4 1.39±0.22 0.61 8 1.24±0.32－8.17 Fr.2不同劑量組20.86±0.31 39.63 4 0.84±0.33* 48.15*8 0.75±0.23* 53.70*

由表2可知，組分Fr.2繼續用201×4陰離子交換樹脂柱處理所得組分Fr.4，在低、中、高劑量抑瘤率分別為45.28%、50.31%和55.35%，而組分Fr.3（201×4樹脂上樣流出液）不具有抑瘤活性或活性很低（抑瘤率≤23.47%）。

表2 組分Fr.3和Fr.4對小鼠S180實體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 2 Anti-tumor effect of Fr.3 and Fr.4 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

表2 組分Fr.3和Fr.4對小鼠S180實體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 2 Anti-tumor effect of Fr.3 and Fr.4 on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05（Compared with the model group，*P＜0.05）。

組別劑量/（mg·kg－1）瘤質量/g抑瘤率/%模型組－1.59±0.33－Fr.3不同劑量組2001.64±0.3214.12 4001.63±0.3318.35 8001.72±0.3323.47 Fr.4不同劑量組2000.87±0.3545.28 4000.79±0.31*50.31*8000.71±0.22**55.35**

由以上數據可以可知，獨角蓮提取物經過抑瘤活性追蹤和離子交換樹脂分離純化后，得到的組分Fr.4仍具有顯著的抑瘤活性。

4.3 L-精氨酸的抑瘤活性

獨角蓮化合物1與同等劑量的L-精氨酸對照品對小鼠S180實體瘤的生長抑制結果顯示，中、高劑量L-精氨酸能夠顯著抑制小鼠S180實體瘤的生長，抑瘤率分別為48.17%、55.48%。表明L-精氨酸在一定劑量范圍內對小鼠S180實體瘤具有劑量依賴性，且與同等劑量的獨角蓮化合物1組分效果相當（見表3）。

表3 化合物1和L-精氨酸對小鼠S180實體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 3 Anti-tumor effect of compound 1 and L-arginine on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

表3 化合物1和L-精氨酸對小鼠S180實體瘤的抑瘤作用(±s)Tab 3 Anti-tumor effect of compound 1 and L-arginine on sarcoma-180 ascite tumor-bearing mice (±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（Compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01）。

組別劑量/（mg·kg－1）瘤質量/g抑瘤率/%模型組－3.01±0.33－化合物1 82.18±0.3127.57 241.53±0.25*49.20*721.33±0.22**55.81**L-精氨酸 82.21±0.3326.58 241.56±0.22*48.17*721.34±0.29*55.48*

5 討論

大量的藥理學實驗證實獨角蓮水煎液具有顯著的抗腫瘤活性，但到目前為止其有效成分仍不明確。為了對獨角蓮的抗腫瘤活性成分進行研究，本課題組摸索過提取其他成分，諸如皂苷和多糖類成分，但經荷瘤小鼠S180抗腫瘤實驗篩選發現其活性很低甚至沒有。本實驗室經過對獨角蓮提取物抑瘤活性研究初步確定了Fr.1和Fr.2給藥劑量范圍2～8 g·kg－1、Fr.3和Fr.4給藥劑量范圍200～800 mg·kg－1、化合物1和精氨酸給藥劑量范圍8～24 mg·kg－1。本文在上述工作的基礎上，選擇抗腫瘤活性顯著的大極性水提液進行研究，最終經HPLC純化得單體化合物1，經鑒定其為L-精氨酸，用同等劑量的L-精氨酸對照品作為對照，發現抑瘤活性與化合物1基本一致。該實驗初步證明獨角蓮抗腫瘤活性的有效成分之一是L-精氨酸。

張劍等[13-14]均報道L-精氨酸具有一定的抗腫瘤活性；Grossie等[15]認為，小劑量和過高劑量L-精氨酸均能促進腫瘤生長，只有合適劑量才能抑制腫瘤；也有報道認為L-精氨酸對腫瘤生長無影響，但可促進化療藥物發揮療效[16]。鑒于此，L-精氨酸的抗腫瘤活性作用機制，還有待進一步研究和探討。

本實驗采用體內實驗活性追蹤法對獨角蓮抗腫瘤有效成分進行了追蹤，最終找到了具有抗腫瘤作用的活性成分之一——L-精氨酸，但由于L-精氨酸抗腫瘤機制不明，不排除是多種成分協同作用產生活性的可能性。本文為獨角蓮抗腫瘤活性研究提供一定的參考，如需明確抗腫瘤機制，還需要進一步研究。