基于UPLC指紋圖譜、含量測定及化學計量學的乳香質量評價

魏龍吟，毛民，沙皓淳，李欣欣，常阿倩，陳冬玲，尹貽慧，張凱，焦鳴杰，陳倩，徐文婕，李飛*（.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 0488；.北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，北京 00079）

乳香為橄欖科植物乳香樹（Boswellia carterii Birdw.）及同屬植物（Boswellia bhaw-dajianaBirdw.）樹皮滲出的樹脂，味辛、苦、溫，歸心、肝、脾經，有活血定痛、消腫生肌之功效，臨床上主要用于胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經經閉、產后瘀阻、癥瘕腹痛、風濕痹痛、筋脈拘攣、跌打損傷、癰腫瘡瘍等[1]。以產地區分的埃塞俄比亞乳香及索馬里乳香為我國常用品。

有研究從乳香中分離得到五環三萜、四環三萜、大環二萜等萜類成分以及多種揮發油類成分，其中五環三萜類化合物最具特征性，而乳香酸為其中最具代表性的藥理活性成分[2]。其中11-羰基-β-乙酰乳香酸、11-羰基-β-乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸等乳香酸類成分具有抗炎[3]、抗潰瘍[4]、抗腫瘤[5]、改善記憶[6]、保護心腎[7-8]等藥理作用。

現有乳香質量控制研究主要為乳香酸類成分含量測定及HPLC指紋圖譜。其中大部分含量測定研究僅對11-羰基-β-乳香酸和11-羰基-β-乙酰乳香酸1～2種成分定量[9-10]，分析成分較少，或是采用UPLC-MS/MS法測定多種乳香酸含量[11]，儀器較為復雜，而現有的HPLC指紋圖譜研究[12-14]存在色譜峰分離度較低或樣品來源單一、共有峰數量少的問題，由此可見現有研究難以較全面、準確、簡便地反映整體質量。因此，本文嘗試建立乳香UPLC指紋圖譜以及5種乳香酸的含量測定方法，結合化學計量學對收集到的26批乳香飲片指紋圖譜進行分析，為乳香質量控制、評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）（美國沃特世科技有限公司，PDA檢測器，Empower色譜工作站）；ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT-25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司、DFT-50A）。

1.2 試藥

生品飲片來源信息見表1。11-羰基-β-乙酰乳香酸（批號：ST00940120）、3-乙酰基-β-乳香酸（批號：ST79530120）、11-羰基-β-乳香酸（批號：ST80640105）、α-乳香酸（批號：ST16340105）、β-乳香酸（批號：ST80740105）對照品（上海詩丹德標準技術服務有限公司，純度均≥98%）。

表1 26批乳香生品飲片來源信息Tab 1 Sample source informations of frankincense pieces

HPLC級乙腈（美國Fisher公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；磷酸（分析純、天津市大茂化學試劑廠）；甲醇（分析純、北京化工廠）。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試品溶液 取乳香樣品，粉碎（過4號篩），精密稱定0.1 g，加入甲醇20 mL，稱重，超聲處理30 min后（功率 500 W，頻率 40 kHz），甲醇補重，取續濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液 取11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質量濃度為0.606、0.606、0.642、0.650、0.848 mg·mL－1的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。以0.1%磷酸水為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫：0～4 min，60%B；4～5 min，60%～70%B；5～35 min，70%B；35～60 min，70%～100%B。流 速0.3 mL·min－1，檢測波長210 nm，柱溫30℃，進樣量5 μL。

2.3 乳香指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 按“2.1.1”項下方法制備乳香（S7）供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。將圖譜導入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”進行分析，相似度均大于0.99。以6號峰的保留時間及峰面積為參照，計算得到其他各共有峰相對保留時間及峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 按“2.1.1”項下方法制備乳香（S7）供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖。將圖譜導入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”進行分析，相似度均大于0.95。以6號峰為參照，計算得其他各共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%，表明樣品在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取乳香（S7）樣品粉末6份，每份0.1 g，按“2.1.1”項下樣品制備方法平行制備6份，按“2.2”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。將圖譜導入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”進行分析，得到相似度均大于0.95，以6號峰為參照，計算得其他各共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.3.4 乳香指紋圖譜的建立 取各批次乳香樣品，按“2.1.1”項下方法制備樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”進行分析，以 S7樣品為參照圖譜，使用平均數法結合多點校正進行匹配，時間窗寬度為0.1 min，得到疊加指紋圖譜（如圖1）及對照圖譜（如圖2A）。

圖1 26批乳香樣品UPLC疊加圖譜（S1～S26）及對照圖譜（R）Fig 1 UPLC fingerprints of 26 batches of frankincense（S1～S26）and reference fingerprints（R）

共確定出24個共有峰，通過與混合對照品色譜圖（見圖2B）的比對，確認了5個乳香酸成分色譜峰，且分離度良好。

圖2 乳香對照指紋圖譜（A）和混合對照品（B）的UPLC色譜圖Fig 2 Frankincense referential fingerprint（A）and mixed reference of UPLC（B）

2.3.5 指紋圖譜相似度評價 根據“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”得出的26批乳香樣品與對照指紋圖譜相似度結果見表2。由表2可知，26批乳香樣品與對照指紋圖譜（R）相比較，相似度結果在0.762～0.989，其中23批乳香指紋圖譜相似度大于0.89，占總批次的88.46%，1批乳香相似度低于0.80，占總批次的3.85%，表明大部分批次乳香樣品相似度差異較小。

表2 26批乳香樣品指紋圖譜相似度評價結果Tab 2 UPLC fingerprints similarity of 26 batches of frankincense

2.4 化學計量學分析

2.4.1 聚類分析 以乳香樣品指紋圖譜的24個共有峰的峰面積為變量，導入SAS 9.2軟件，采用離均差平方和法對樣品進行聚類分析，結果見圖3。當分類距離為8.5時，26批樣品可聚為3類，其中第一類編號為S1、S7～S12、S19的8個批次，第二類為編號S2～S5、S14～S16、S18、S22～S25的12個批次，第三類為編號S6、S13、S17、S20、S21、S26的6個批次，說明不同批次的乳香樣品整體質量存在一定差異性。

圖3 26批次乳香聚類分析結果Fig 3 Dendrogram of 26 batches of frankincense

2.4.2 主成分分析 將26批乳香樣品指紋圖譜的24個共有峰峰面積導入SIMCA-P14.1軟件進行因子分析，結果見表3，共提取到5個主成分，其中前四個主成分的累計方差貢獻率為85.21%，特征值大于1，說明選取4個主成分即可表征乳香指紋圖譜的85%以上的信息，可用于評價乳香質量。

表3 乳香樣品主成分分析特征值及方差貢獻率Tab 3 Characteristic values of principal components and variance contribution rate of frankincense

通過選取的4個主成分繪制主成分得分圖（見圖4A），得到聚類分析中第一類主要位于右上象限，第二類主要位于中部，第三類主要位于右下象限，說明24批次主成分分析結果與聚類分析結果相似，其中S14、S16批次可能由于主成分未包含全部信息從而與聚類分析結果存在差異。

將得到的成分矩陣進行正交旋轉，得到主成分因子旋轉載荷矩陣表，見表4。以載荷值的絕對值＞0.6記錄，得到色譜峰3、7～9、11、13、16（α-乳香酸）、18～20、23、24（3-乙酰基-β-乳香酸）在主成分1上有較高載荷，色譜峰5（11-羥基-β-乳香酸）、6、10、12（11-羰基-β-乙酰乳香酸）、14、15、16（α-乳香酸）、17（β-乳香酸）、24（3-乙酰基-β-乳香酸）在主成分2上有較高載荷，色譜峰1、22在主成分3上有較高載荷，表明了這些色譜峰所代表成分的含量與主成分較高的相關程度。

表4 主成分因子旋轉載荷矩陣表Tab 4 Composition matrix of principal component factors

以4個主成分 M1、M2、M3、M4作為乳香質量信息表征載體，將24個共有峰峰面積進行標準化處理，并在主成分的線性表達式中進行向量運算，將計算結果與主成分的方差貢獻率加權，得到乳香質量評價表達式：M＝47.92% M1＋35.64% M2＋11.16% M3＋5.29% M4，最終計算后得到的綜合評分結果見表5。聚類分析第一類中的 S19、S10、S12、S11、S1的5個批次綜合評分排序前五，S7、S9、S8綜合評分排序在7、9、11位，排序均較高，表明聚類中的第一類，同時主成分分析位于右上象限的乳香整體質量較好。

表5 26批次乳香主成分得分、綜合得分及排名Tab 5 Principal component score，comprehensive score，ranking of 26 batches of frankincense

2.4.3 偏最小二乘判別分析 將主成分分析得分圖進行監督模式識別方法偏最小二乘判別建模分析，得到相應得分圖（見圖4B），并采用變量重要投影（VIP）法篩選出影響乳香批次間差異的主要成分，結果見圖5。以VIP值＞1.0為標準，可篩選出對乳香質量有關鍵性影響的10個成分，按影響大小排序分別為5（11-羰基-β-乳香酸）、2、8、12（11-羰基-β-乙酰乳香酸）、15、6、10、4、24、17（β-乳香酸）號色譜峰對應成分。

圖4 26批乳香樣品主成分分析（A）及偏最小二乘判別分析（B）得分圖Fig 4 PCA（A）and PLS-DA（B）score diagrams of 26 batches of frankincense

圖5 偏最小二乘判別分析VIP值圖Fig 5 VIP of PLS-DA

2.5 5種乳香酸類成分含量測定

2.5.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液，稀釋成系列線性溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，進行線性回歸，結果見表6。

表6 5種乳香酸類成分線性關系Tab 6 Linear relationships of 5 kinds of boswellic acids

2.5.2 精密度試驗 取乳香（S7）供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的峰面積，計算RSD分別為0.34%、0.54%、0.26%、0.28%、0.57%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 精密稱取乳香（S7）樣品粉末6份，每份0.1 g，按“2.1.1”項下樣品制備方法平行制備6次，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，結果11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的峰面積，計算RSD分別為2.5%、1.6%、0.95%、2.0%、0.78%，均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.5.4 穩定性試驗 取乳香（S7）供試品溶液按“2.2”項下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結果11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的RSD值分別為0.42%、0.17%、1.3%、1.9%、0.28%，RSD值均小于3%，說明樣品在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收試驗 取已知含量乳香（S7）樣品粉末6份，每份0.05 g，分別精密加入適量對照品，按“2.1.1”項下方法制備，進樣測定，計算11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸的平均加樣回收率依次為96.37%、97.86%、98.99%、100.57%、99.51%，RSD值分別為1.2%、2.7%、2.0%、2.1%、2.8%，表明該方法回收率良好。

2.5.6 含量測定結果 取各批次乳香樣品，按“2.1.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.2”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄對應色譜峰的峰面積，計算5種乳香酸含量，結果見表7。

表7 26批次乳香中5種乳香酸類成分含量測定結果(%，n＝3)Tab 7 Results of content determination of 5 kinds of boswellic acids in 26 batches of frankincense (%，n＝3)

3 討論

試驗前期對色譜條件進行了考察，考察了4種不同流動相系統（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水），結果顯示乙腈-磷酸水系統效果最優，進一步對磷酸水酸度（0.05%磷酸、0.2%磷酸、0.5%磷酸）、不同的柱溫（35、40℃）、不同進樣量（2、4、6、8 μL）、不同檢測波長（254、270、280 nm）進行考察，最終確定了本試驗的色譜條件，所得到的色譜圖基線平穩，色譜峰信息較多。

26批乳香樣品的相似度為0.762～0.989，聚類分為3類，顯示出乳香樣品存在的質量差異性，表明對乳香質量進行控制的必要性；而同來源、同產地的13批北京同仁堂乳香樣品的相似度在0.904～0.989，批次間差異小，質量穩定，提示選擇同來源、同產地的乳香對用藥過程穩定性、臨床療效有一定幫助。

在明確質量差異貢獻較大的指標性成分時，確定了對乳香質量有較大影響的10個色譜峰成分，通過對照品的指認，僅可確定其中3種成分，后續可結合液質聯用技術，對未知的7個色譜峰成分進行定性定量研究，以更準確、全面地控制乳香的質量。

本研究建立了乳香中5種乳香酸類成分的含量測定方法及乳香的UPLC指紋圖譜，結合HCA、PCA及PLS-DA，形成了乳香品質評價的化學識別模型，并可篩選出影響質量的關鍵性成分。該方法可更簡便、準確、全面地評價乳香質量，為完善乳香質量評價體系提供一定參考。