引起舟山地區(qū)凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病病原的分離與鑒定

侯巧利，王庚申，謝建軍，施 慧，許文軍

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei是我國(guó)四大養(yǎng)殖蝦類(lèi)之首，2019 年該品種養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)181.5 萬(wàn)t，占我國(guó)蝦類(lèi)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的39%以上[1]。“早期死亡綜合征”（early mortality syndrome,EMS）是近年來(lái)在東南亞和墨西哥等地凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中爆發(fā)的一種新疾病，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。2009 年開(kāi)始，該病在我國(guó)南方的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)流行，病蝦嗜睡，出現(xiàn)空腸空胃，肝胰腺顏色發(fā)白，部分患病蝦的肝胰腺呈萎縮或腫大等癥狀,該疫病病程短，短時(shí)間內(nèi)死亡率可達(dá)80%以上[4-5]。2012 年8 月，亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)絡(luò)（NACA）根據(jù)該疫病導(dǎo)致的對(duì)蝦肝胰腺組織病理學(xué)特征，正式命名該疫病為急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）[6]。李俊德等[7]研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致對(duì)蝦爆發(fā)AHPND 的高致病性副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus都攜帶一個(gè)70 kb 大小的pVA1 樣質(zhì)粒，該質(zhì)粒上的2 個(gè)基因pirAvp和pirBvp編碼了2 種毒力蛋白，自然缺乏pir基因或人為敲除pir基因，菌株會(huì)明顯失去致病力，證明了毒素蛋白PirAvp和PirBvp是引起對(duì)蝦AHPND 的關(guān)鍵。最新研究表明，除了副溶血性弧菌攜帶該毒力基因，在其他致病性弧菌中也發(fā)現(xiàn)了含pir毒素基因的pVA1 樣質(zhì)粒，特別是哈維氏弧菌V.harveyi、歐文斯氏弧菌V.owensii和坎貝氏弧菌V.campbellii等[8-10]。

自2014 年開(kāi)始，舟山多家凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)苗種在投放后25 d 左右出現(xiàn)規(guī)模性的急性死亡現(xiàn)象。病蝦主要表現(xiàn)為蝦殼變軟，體表色素點(diǎn)異常增多，肝胰腺發(fā)白萎縮，與已報(bào)道的AHPND 臨床病癥相似。2014-2019 年期間，本實(shí)驗(yàn)室從舟山地區(qū)臨床發(fā)病對(duì)蝦肝胰腺中共分離到30 株病原菌，為了探討引起舟山對(duì)蝦養(yǎng)殖中引發(fā)疑似AHPND 的病原菌流行病學(xué)，本研究通過(guò)16S rRNA 基因及gyrB、rpoA等基因同源性檢索分析對(duì)30 株分離菌進(jìn)行了鑒定；用Nested-PCR 方法從30 株臨床分離株鑒定出10 株pirABVP陽(yáng)性菌株，選取5 株代表性菌株，分別進(jìn)行了毒力基因pirAvp和pirBvp的PCR 擴(kuò)增分析，同時(shí)通過(guò)浸泡感染方式，對(duì)5 株細(xì)菌的致病性開(kāi)展了初步研究，以期為舟山凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中病害診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用細(xì)菌與對(duì)蝦

本研究中共使用30 株細(xì)菌，為2014-2019 年期間從浙江舟山地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)疑似患AHPND 的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織中分離獲得。

人工感染試驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦，購(gòu)自浙江舟山登步某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)約2～4 cm，體重約為（0.88±0.2）g，水溫25～27 ℃，早晚各投喂1 次配合飼料，經(jīng)pirABVP毒力基因PCR 檢測(cè)為陰性后，暫養(yǎng)1～3 d 備用。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，TCBS 瓊脂購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 購(gòu)自TaKaRa 公司，實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA 模板的制備與pirABVP基因PCR 擴(kuò)增

將實(shí)驗(yàn)室甘油保存試驗(yàn)菌株在TSA 平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察菌株形態(tài)以及熒光產(chǎn)生情況。挑取TSA 平板上菌落形態(tài)、大小一致的單菌落，使用DNA 抽提試劑盒（Qiagen 公司），按說(shuō)明書(shū)提取30 株細(xì)菌的總DNA，作為PCR 擴(kuò)增的模板。

pirABvp基因PCR 檢測(cè)，采用《世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》第2.2.1 章4.3.1.2.3.1.10（AP4 套式PCR 法）進(jìn)行AHPND 相關(guān)毒力基因pirABvp的PCR 擴(kuò)增[11]。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：17.25 μL超純水，2.5 μL 的10×Reaction buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），2.5 μL 模板DNA，上下游引物（10 pmol·L-1）各0.25 μL，0.25 μL Taq 酶。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。

1.2.2 細(xì)菌鑒定與篩選

參考文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)合成細(xì)菌16S rRNA、gyrB 和ropA 基因的通用引物（表1），PCR 擴(kuò)增方法按照張曉君等[13]及徐加濤等[14]方法進(jìn)行，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海生物工程公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。運(yùn)用DNAMAN 7.0 軟件對(duì)測(cè)序獲得的16S rRNA、gyrB 和ropA 基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定分離菌株的細(xì)菌種類(lèi)，從pirABVP陽(yáng)性菌株中篩選出代表性菌株進(jìn)行后續(xù)病原菌致病性分析試驗(yàn)。

表1 相關(guān)功能基因引物序列Tab.1 Primer sequence of related functional genes

1.2.3 菌株特定基因的PCR 擴(kuò)增

以1.2.1 中提取的DNA 作為PCR 模板，對(duì)選取的細(xì)菌進(jìn)行副溶血弧菌相關(guān)毒力基因的PCR 檢測(cè)，包括分子伴侶蛋白基因groEL、耐熱直接溶血毒素基因tdh、相對(duì)耐熱溶血毒素基因trh 和不耐熱溶血毒素基因tlh，同時(shí)對(duì)pirAVP和pirBVP基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定，引物見(jiàn)表2，PCR 反應(yīng)體系同1.2.1。

表2 副溶血弧菌相關(guān)毒力基因檢測(cè)引物Tab.2 Primers for virulence detection of VP-AHPND specific genes

1.2.4 人工感染試驗(yàn)及組織病理分析

采用不同的浸泡感染方法對(duì)健康對(duì)蝦進(jìn)行回感試驗(yàn)。試驗(yàn)菌分別在TSA 培養(yǎng)基上進(jìn)行增菌培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，1.5%的無(wú)菌生理鹽水洗脫菌苔，重懸于1.5%的無(wú)菌生理鹽水中，分光光度計(jì)測(cè)定菌液在OD 550 nm 下的吸光度值，確定細(xì)菌含量。同時(shí)取適量菌液涂布TSA 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)。

感染試驗(yàn)分別設(shè)置試驗(yàn)A 組、試驗(yàn)B 組及空白對(duì)照組，各試驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)平行，每組20 尾蝦。將60尾健康對(duì)蝦在1 L 含2×108CFU·mL-1細(xì)菌的海水中浸泡，15 min 后將浸泡后的對(duì)蝦轉(zhuǎn)移到含10 L 養(yǎng)殖水體的試驗(yàn)缸中；在試驗(yàn)A 組的養(yǎng)殖水體中加入預(yù)先制備的菌液，使菌含量最終為2×106CFU·mL-1；試驗(yàn)B 組的養(yǎng)殖水體不加菌；對(duì)照組采用10 L 海水浸泡，15 min 后轉(zhuǎn)移到同樣體積的養(yǎng)殖水體中。各試驗(yàn)組在浸泡期間保持充氧，水溫保持恒定為（26±2）℃，各組早晚各投喂1 次，試驗(yàn)連續(xù)觀察7 d，計(jì)算各組累計(jì)死亡率。

取瀕死對(duì)蝦的肝胰腺和腸道組織固定于Bouin 氏液中，在24 h 后換數(shù)次75%乙醇沖洗，最后保存于75%的乙醇中。固定樣品經(jīng)乙醇系列及丙酮脫水過(guò)程，移入二甲苯溶液中透明，浸蠟包埋后切片，烤干后展片以蘇木精-伊紅染色法（H&E）染色，顯微鏡下觀察拍照[15-17]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌pirABvp 基因PCR 檢測(cè)結(jié)果

30 株菌在TSA 和TCBS 培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)良好，其中7 株菌在暗視野下可以觀察到顯著的熒光（圖1）。為了確認(rèn)30 株臨床分離菌是否攜帶pirABvp基因，采用OIE《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》的Nested-PCR 法對(duì)細(xì)菌株進(jìn)行了預(yù)篩選。結(jié)果顯示：30 株細(xì)菌中共有10 株菌攜帶pirABvp基因，占比為30%（圖2、圖3）。

圖1 部分菌株黑暗處可觀察到熒光Fig.1 Fluorescence can be observed in darkness of some strains

圖2 AHPND 一次PCR 檢測(cè)圖Fig.2 Electropherograms of the first round PCR product

圖3 AHPND 二次PCR 檢測(cè)圖Fig.3 Electropherograms of the second round PCR product

2.2 16S rRNA 基因鑒定及細(xì)菌篩選

經(jīng)16S rRNA 及gyrB、rpoA 等基因分析比對(duì)結(jié)果顯示，30 株試驗(yàn)菌株中有副溶血弧菌7 株，坎貝氏弧菌8 株，歐文斯氏弧菌7 株；而10 株pirABVP陽(yáng)性菌株中，有4 株為副溶血弧菌、2 株為歐文斯氏弧菌和5株為坎貝氏弧菌（表3）。從10 株pirABVP陽(yáng)性菌中篩選出4 株代表性菌株用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)，分別為1 株副溶血弧菌（1406001）、1 株歐文斯氏弧菌（1906001）和2 株坎貝氏弧菌（1509001、1904001），以及1 株坎貝氏弧菌pirAB—（1508001），其中2 株坎貝氏弧菌在暗視野下可以觀察到顯著的熒光。菌株1406001 基因序列與GenBank 中已發(fā)布的致AHPND 的高致病性副溶血弧菌（GQ205448）的序列具有99.93%的相似度性；菌株1508001、1509001、1904001 序列與坎貝氏弧菌序列（MT207282）相似度為99.35%；菌株1906001 基因序列與歐文斯氏弧菌序列相似度99.65%。

表3 11 株菌16S rRNA、gyrB、rpoA 序列在GenBank 中同源性最高的基因序列Tab.3 The 16S rRNA, gyrB,rpoA sequence of 11 strains showed the highest homology in GenBank

2.3 細(xì)菌特定基因的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)副溶血弧菌毒力分子標(biāo)記基因tdh、trh 和tlh 及副溶血弧菌特異性標(biāo)志基因groEL進(jìn)行檢測(cè)，30 菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，7 株副溶血弧菌均攜帶groEL 基因分子蛋白，且含有tlh基因，不攜帶副溶血弧菌臨床毒力基因tdh和trh；其中包括菌株1406001，其它4 株菌對(duì)tdh、trh、tlh以及groEL基因PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（表4）。

表4 菌株毒力基因鑒定Tab.4 Virulence gene results of bacterial strain

運(yùn)用BLAST 軟件對(duì)副溶血弧菌（1406001）、坎貝氏弧菌（1509001、1904001）和歐文斯氏弧菌（1906001）的pirAVP和pirBVP樣基因的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，4 株pirABVP陽(yáng)性菌的pirAVP和pirBVP基因序列之間的同源性為100%，與已報(bào)道的副溶血性弧菌質(zhì)粒的pirAvp和pirBvp樣基因序列（登錄號(hào)為MH718270）相比對(duì)分析，覆蓋率100%，相似度為100%。根據(jù)Nested-PCR 檢測(cè)結(jié)果以及菌株的pirAVP和pirBVP基因的測(cè)序分析結(jié)果顯示，該4 株菌被初步確定為可以導(dǎo)致AHPND 的致病菌。

2.4 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參考TRAN,et al[18]的試驗(yàn)方法，對(duì)健康凡納濱對(duì)蝦開(kāi)展人工感染試驗(yàn)，測(cè)定不同菌株的致病性，整個(gè)感染試驗(yàn)周期7 d。實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組對(duì)蝦和不攜帶pirAVP和pirBVP基因的菌株1508001 感染組對(duì)蝦肝胰腺正常，對(duì)蝦攝食和活力正常，未出現(xiàn)死亡；試驗(yàn)過(guò)程中，持續(xù)細(xì)菌暴露組（試驗(yàn)A 組）對(duì)蝦感染后發(fā)病較快，感染12 h 后對(duì)蝦活力明顯下降，并出現(xiàn)發(fā)病死亡的個(gè)體，24～72 h 內(nèi)死亡對(duì)蝦數(shù)量急劇增加，最高達(dá)85%；試驗(yàn)B 組對(duì)蝦，在感染18 h 后開(kāi)始出現(xiàn)零星死亡，24～72 h 內(nèi)對(duì)蝦死亡數(shù)量緩慢增加，死亡率最高為55%。試驗(yàn)A 組中，菌株1406001 感染對(duì)蝦后，對(duì)蝦發(fā)病最快，在感染72 h 內(nèi)死亡率急劇升高，96 h 內(nèi)實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦死亡率高達(dá)90%；菌株1904001 感染對(duì)蝦后，對(duì)蝦發(fā)病比較緩慢，在72 h 內(nèi)死亡率只有50%，見(jiàn)圖4；試驗(yàn)結(jié)果表明4 株菌的毒力有一定差異，環(huán)境中高濃度致病菌增加了對(duì)蝦死亡率。在感染7 d 后，所有存活的對(duì)蝦基本都出現(xiàn)對(duì)蝦體表色斑點(diǎn)異常增多，部分對(duì)蝦甲殼及須發(fā)紅明顯，空腸空胃，腹節(jié)肌肉透明度下降，肝胰腺顏色變?yōu)榈S色甚至發(fā)白等癥狀（圖5）。

圖4 實(shí)驗(yàn)各組的累積死亡率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.4 The cumulative mortality of stains in different treatments（mean±SD）

圖5 感染組與空白組凡納濱對(duì)蝦Fig.5 The shrimp infected by the isolated strain and normal L.vannamei

2.5 組織病理學(xué)觀察

浸浴感染試驗(yàn)過(guò)程中，取樣瀕死對(duì)蝦肝胰腺經(jīng)石蠟切片和HE 染色制片，進(jìn)行光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示：對(duì)照組對(duì)蝦的肝胰腺組織管腔結(jié)構(gòu)完整，可以清晰分辨出吸收細(xì)胞、分泌細(xì)胞及纖維細(xì)胞[19]（圖版I-1）。與對(duì)照組相比，攜帶pirABVP的質(zhì)粒的菌株1406001、1509001、1904001、1906001 感染組對(duì)蝦的肝胰腺組織發(fā)生嚴(yán)重的病理學(xué)變化，肝胰腺組織中的管狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重崩塌，部分功能細(xì)胞缺失，血淋巴細(xì)胞增多（圖版I-2）；部分肝胰腺小管上皮層變薄，上皮細(xì)胞脫落至管腔內(nèi)（圖版I-3），無(wú)法分辨出B細(xì)胞、R 細(xì)胞和F 細(xì)胞，小管中可見(jiàn)大量細(xì)菌，且出現(xiàn)大量血淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象（圖版I-4）；細(xì)胞核也出現(xiàn)腫大（圖版I-5），呈現(xiàn)典型的AHPND 病理學(xué)特征。

圖版Ⅰ 凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺HE 染色組織切片觀察Plate Ⅰ HE-stained histological sections of the hepatopancreas of L.vannamei

腸道組織切片結(jié)果顯示，正常對(duì)蝦腸道上皮細(xì)胞排列緊密，上皮細(xì)胞與基膜緊密相連，細(xì)胞間隙清晰，腸道內(nèi)壁向腸腔內(nèi)形成褶皺[20]（如圖版II-1）。菌株感染后，凡納濱對(duì)蝦腸道組織形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞游離端絨毛脫落，上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核肥大（圖版II-2）；基膜與上皮細(xì)胞出現(xiàn)間隙，腸道損傷嚴(yán)重則會(huì)出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落（圖版II-3）；細(xì)胞核邊緣模糊不清等癥狀（圖版II-4）。

圖版Ⅱ 凡納濱對(duì)蝦腸道組織切片Plate Ⅱ Histological examination of L.vannamei midguts

3 討論

本文對(duì)舟山地區(qū)2014 年至2019 年期間，疑似發(fā)生AHPND 凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺中分離到的病原菌進(jìn)行了細(xì)菌鑒定。根據(jù)16S rRNA、gyrB 及rpoA 等基因序列比對(duì)分析結(jié)果顯示舟山地區(qū)患病凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中分離到的病原菌主要以副溶血弧菌、坎貝氏弧菌及歐文斯氏弧菌為主，其中有10 株菌攜帶pirABVP毒力基因的菌株，占總比的30%。選取4 株pirABVP陽(yáng)性菌株進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)，結(jié)果攜帶pirABVP毒力基因的副溶血弧菌、歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌三株試驗(yàn)菌均可導(dǎo)致健康對(duì)蝦發(fā)病死亡，且表現(xiàn)的臨床癥狀和組織病理變化與報(bào)道的AHPND 相似；但不攜帶pirABVP基因的菌株則對(duì)健康對(duì)蝦沒(méi)有致病性。LIU Liyuan,et al[9]對(duì)歐文斯氏弧菌繼代培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)pirAB 基因具有不穩(wěn)定性，在純培養(yǎng)條件下pirAB 基因往往會(huì)丟失，本試驗(yàn)結(jié)果顯示從疑似患AHPND 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺上分離到的部分病原性弧菌并不攜帶pirABVP毒力基因，是否存在pirAB 基因丟失還有待進(jìn)一步研究。攜帶pVA1 型質(zhì)粒的高致病性副溶血弧菌最初被認(rèn)為是對(duì)蝦AHPND 唯一致病菌，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)不同物種間pVA1 型質(zhì)粒發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌及歐文斯氏弧菌等弧菌也可攜帶pVA1 型質(zhì)粒，并引起對(duì)蝦發(fā)病。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高致病性副溶血弧菌以及攜帶pirAB 毒力基因的歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌是舟山地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦爆發(fā)AHPND 的主要致病菌。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道顯示16S rRNA 基因和hsp60、gapA、gyrB、recA、rpoA 等管家基因的PCR 擴(kuò)增分析是弧菌種類(lèi)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究分析的主要工具。本文采用16S rRNA 基因，rpoA、gyrB、groEL 等管家基因和tdh、trh、tlh 等毒力基因相結(jié)合對(duì)弧菌進(jìn)行了鑒定分類(lèi)。tdh、trh 和tlh 是致病性副溶血弧菌的重要毒力因子，但TANIGUCHI,et al[21]研究發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌無(wú)論是臨床分離株，還是環(huán)境分離株都攜帶tlh 毒力基因。劉杰等[22]對(duì)67 株蝦源副溶血弧菌進(jìn)行tdh、trh 和tlh 毒力基因檢測(cè)，結(jié)果所有菌株均為tdh～-trh～-tlh～+。本次試驗(yàn)中共檢出7 株副溶血弧菌，毒力基因PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，7 株副溶血弧菌均攜帶毒力基因tlh，但不攜帶trh 和tdh 基因。本次實(shí)驗(yàn)中選取了1 株副溶血弧菌進(jìn)行感染試驗(yàn)，該菌株不攜帶tdh 和trh毒力基因，但tlh 毒力基因PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性；而其它3 株pirABVP陽(yáng)性非副溶血弧菌試驗(yàn)菌株經(jīng)PCR 檢測(cè)均不攜帶這3 種毒力基因。感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 株pVA1 陽(yáng)性菌株對(duì)健康對(duì)蝦都有致病性，但是攜帶tlh基因的副溶血弧菌感染組對(duì)蝦發(fā)病最快，臨床癥狀最明顯，死亡率最高。本次實(shí)驗(yàn)中tlh 毒力基因的存在是否加劇了菌株的致病性還有待進(jìn)一步研究。

AHPND 是一種嚴(yán)重危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的疫病，也是近年來(lái)全球?qū)ξr大規(guī)模減產(chǎn)的重要細(xì)菌性疾病之一[23-25]。對(duì)AHPND 最初的研究認(rèn)為攜帶pVA1 致病質(zhì)粒的副溶血弧菌是該病的致病菌[26]，但近年來(lái)，更多的研究報(bào)道證實(shí)其它攜帶pVA1 的弧菌也可以引起對(duì)蝦AHPND 的發(fā)生。DONG Xuan,et al[10]在暴發(fā)AHPND 的對(duì)蝦肝胰腺中分離到一株坎貝氏弧菌，經(jīng)PCR 檢測(cè)這株弧菌攜帶pVA1 型質(zhì)粒，感染試驗(yàn)也證實(shí)了這株病原菌具有致對(duì)蝦AHPND 的能力；HAN,et al[27]也在患AHPND 的對(duì)蝦上分離到攜帶pVA1型質(zhì)粒的坎貝氏弧菌；目前的研究普遍認(rèn)為pVA1 型質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致新AHPND 致病弧菌的產(chǎn)生。本次試驗(yàn)中分離獲得的10 株pirABVP陽(yáng)性細(xì)菌主要以副溶血弧菌、歐文斯氏弧菌和坎貝氏弧菌3 種弧菌為主，實(shí)驗(yàn)中鑒定出2 株攜帶pirABVP陽(yáng)性坎貝氏弧菌，及1 株pirABVP陰性坎貝氏弧菌，而后者對(duì)健康對(duì)蝦沒(méi)有致病性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面證實(shí)pVA1 型質(zhì)粒可能發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了養(yǎng)殖環(huán)境中新AHPND 致病性弧菌的產(chǎn)生。

陳曉玲等[28]對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦養(yǎng)殖塘中弧菌數(shù)量與AHPND 關(guān)系開(kāi)展調(diào)查，結(jié)果顯示養(yǎng)殖環(huán)境中弧菌數(shù)量的增多，AHPND 暴發(fā)的可能性也會(huì)隨之升高。本次試驗(yàn)中，試驗(yàn)A 組采用2×108CFU·mL-1高濃度菌液浸泡15 min，再在養(yǎng)殖水體中維持2×106CFU·mL-1菌量進(jìn)行持續(xù)感染，結(jié)果副溶血弧菌（1406001）感染組對(duì)蝦發(fā)病最快，72 h 內(nèi)即出現(xiàn)大量死亡，96 h 死亡率已高達(dá)95%，而其他3 株菌感染7 d 內(nèi)累計(jì)死亡率也分別達(dá)95%、75%、90%；試驗(yàn)B 組采用2×108CFU·mL-1高濃度菌液浸泡15 min，之后對(duì)蝦在普通海水中養(yǎng)殖，試驗(yàn)開(kāi)始后7 d 內(nèi)，副溶血弧菌（1406001）感染對(duì)蝦累積死亡率為60%、坎貝氏弧菌（1904001）感染對(duì)蝦累積死亡率為50%、坎貝氏弧菌（1509001）和歐文斯氏弧菌（1906001）感染對(duì)蝦累積死亡率均為55%，試驗(yàn)結(jié)果表明，養(yǎng)殖水體中弧菌持續(xù)存在導(dǎo)致對(duì)蝦二次細(xì)菌感染，致其死亡率明顯高于一次細(xì)菌感染。弧菌是一種常見(jiàn)的條件性致病菌，一旦在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中大量滋生，將嚴(yán)重危害規(guī)模化的養(yǎng)殖，尤其是當(dāng)對(duì)蝦本身抵抗力降低時(shí)，弧菌就會(huì)乘虛而入。倪純治等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)養(yǎng)殖池水中弧菌含量高于海區(qū)海水中正常菌含量時(shí)，蝦池的發(fā)病概率就會(huì)升高。目前暫無(wú)有效的藥物治療對(duì)蝦AHPND，對(duì)蝦AHPND 的防治主要還是在對(duì)蝦未發(fā)病時(shí)采取防重于治的防治措施[30]。因此為了預(yù)防對(duì)蝦AHPND，應(yīng)定期檢測(cè)水體和蝦體中的弧菌數(shù)量，盡可能控制水體中弧菌數(shù)量，消除傳染源切斷傳染途徑，創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境，防止其在養(yǎng)殖生產(chǎn)中暴發(fā)。