貴州省刺梨中抗壞血酸含量HPLC 測定方法優(yōu)化

錢志瑤，龔艷麗，梁芳瑜，羅忠圣，徐昌艷，覃容貴*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；4.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.Ros.Monogr.）屬薔薇科薔薇屬植物，為多年生落葉叢生灌木，主要分布于我國貴州、云南、四川、湖南等地區(qū)，尤其以貴州省品種最多、年產(chǎn)量最高[1]，刺梨的營養(yǎng)價(jià)值較高，主要含有抗壞血酸、優(yōu)質(zhì)膳食纖維[2]、多糖、黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）、刺梨甾醇（β-谷甾醇）及三萜類化合物等成分，具有促進(jìn)胃腸道消化[3]、調(diào)節(jié)人體免疫功能、延緩衰老、抑制癌細(xì)胞增殖、抗氧化[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低人體膽固醇、防治糖尿病[5-6]、輻射防護(hù)與抗凋亡等藥理作用[7-8]。

抗壞血酸又名維生素C，是植物和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)合成的一類已糖內(nèi)酯化合物，也是人體必需的一種物質(zhì)，用來維持人體的正常生長發(fā)育，具有清除自由基、抗衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)人體機(jī)能等功效[10]，由于人體內(nèi)缺乏其合成的關(guān)鍵酶導(dǎo)致無法合成抗壞血酸，因此人體內(nèi)抗壞血酸的獲取主要來源于富含抗壞血酸的蔬菜及水果等植物[11]。

試驗(yàn)為探究簡便快捷、測定結(jié)果準(zhǔn)確、用于測定貴州省刺梨中抗壞血酸含量的HPLC 測定法，以GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”[12]中第一法高效液相色譜法的色譜條件為基礎(chǔ)，分別對流動(dòng)相、柱溫、流速進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的色譜條件，并對貴州省刺梨中抗壞血酸進(jìn)行含量測定，將測定的抗壞血酸含量與GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”[12]中第一法高效液相色譜法測定的結(jié)果進(jìn)行比較，確定所優(yōu)化方法的可行性，為貴州省刺梨中抗壞血酸的含量測定，刺梨功能性食品、膳食補(bǔ)充劑和藥物制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更多的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品，貴州迪大科技有限責(zé)任公司；草酸，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；偏磷酸、磷酸二氫鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，默克股份兩合公司；刺梨，貴州省刺梨鮮果，來源見表1。

表1 貴州省刺梨來源Table 1 Sources of Roxburgh in Guizhou province

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，Agilent HPLC 1100 型，美國Agilent公司；色譜柱，ACE Excel 5 C18-AR 250 mm×4.6 mm，5 μm、資生堂C184.6 mm×250 mm，5 μm、XSelectR CSHTMC184.6 mm×250 mm，5 μm；高功率數(shù)控超聲波清洗器，KQ-800KDV 型，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，XSE105DU 型，METTLER TOLEDO；0.45 μm 有機(jī)濾膜，江蘇綠盟科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取貴州省刺梨鮮果榨汁，加水使每毫升刺梨汁中含1 g 刺梨鮮果，過濾，得刺梨汁。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取VC 標(biāo)準(zhǔn)品適量，0.05%草酸溶液稀釋并定容至濃度為0.01 mg/mL，混勻，即得對照品溶液。

1.2.3 樣品溶液的制備

稱取刺梨汁約0.5 g，0.05%草酸溶液稀釋并定容至100 mL，混勻，吸取1mL 樣品稀釋液于10 mL 容量瓶中，0.05%草酸溶液定容，混勻，即得濃度為0.5 mg/mL 樣品溶液。

1.2.4 色譜條件

（1）流動(dòng)相選擇

分別以0.01%、0.05%、0.10%濃度草酸溶液為水相，100%甲醇為有機(jī)相，按水相∶有機(jī)相=98∶2 比例，取對照品溶液、樣品溶液進(jìn)樣檢測，選擇最佳流動(dòng)相水相。

（2）流速選擇

取對照品溶液、樣品溶液，分別用流速0.4、0.7、1.0、1.3 mL/min 進(jìn)樣檢測。

（3）柱溫選擇

取對照品溶液、樣品溶液，分別用柱溫25、30、35 ℃進(jìn)樣檢測。

1.2.5 方法學(xué)考察

（1）耐用性試驗(yàn)

取對照品溶液、樣品溶液，分別使用ACE Excel 5 C18-AR、資生堂C18、XSelectR CSHTMC18色譜柱，進(jìn)樣檢測。

（2）專屬性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、樣品溶液進(jìn)樣檢測，按照式（1）計(jì)算抗壞血酸理論塔板數(shù)，同時(shí)根據(jù)所得色譜圖對刺梨中抗壞血酸色譜峰的分離情況、峰形以及有無干擾峰進(jìn)行判斷。

（3）線性關(guān)系

分別取濃度0.1 mg/mL 的VC 對照品溶液0、0.05、0.5、1.0、2.5、5 mL，0.05%草酸稀釋并定容至10 mL，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液濃度分別為0、0.5、5.0、10、25、50 μg/mL。將其逐次進(jìn)樣檢測，以VC 對照品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)x，相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）精密度試驗(yàn)

取同一對照品溶液于高效液相色譜儀中連續(xù)進(jìn)樣6次，得色譜峰面積，求其平均值、RSD。

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液于0、1、2、3 h 后分別在高效液相色譜儀中進(jìn)樣檢測，得色譜峰面積，求其平均值、RSD。

（6）重復(fù)性試驗(yàn)

按照1.2.3 方法平行配制6 份樣品溶液，于高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，得色譜峰面積，求其平均值、RSD。

（7）回收率試驗(yàn)

稱取0.25 g 刺梨汁于100 mL 容量瓶中9 份，分別加入經(jīng)計(jì)算后已知樣品中VC 含量的80%、100%、120%的VC 對照品溶液（各平行三份），0.05%草酸溶液定容，從中吸取1 mL 溶液，置于10 mL 容量瓶中，0.05%草酸溶液稀釋定容，混勻，于高效液相色譜儀中檢測。根據(jù)樣品中原有抗壞血酸含量、抗壞血酸加入量、樣品測得抗壞血酸量，計(jì)算抗壞血酸的回收率、RSD。

1.2.6 刺梨中抗壞血酸的含量測定

取1 g/mL 刺梨汁按1.2.3 方法進(jìn)行配制，使用本試驗(yàn)優(yōu)化的方法測定各刺梨樣品中抗壞血酸含量。同時(shí)使用GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”[11]中第一法高效液相色譜法測定貴州省刺梨抗壞血酸含量。使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用配對樣本T 檢驗(yàn)對兩種方法測定的刺梨中抗壞血酸含量進(jìn)行比較，判斷所測結(jié)果是否具有差異。

抗壞血酸含量的計(jì)算參考文獻(xiàn)[13]的方法，根據(jù)公式（3）（4）計(jì)算回收率。

式中，X-樣品中抗壞血酸的含量，mg/g；C樣-各樣品抗壞血酸濃度，μg/mL；V0-樣品定容的體積，mL；m-稱樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

通過對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果比較分析得，流動(dòng)相以0.05%草酸-甲醇（98∶2）的配比時(shí)，刺梨中抗壞血酸的色譜峰峰形對稱性較好（圖1）。柱溫的改變對于刺梨中抗壞血酸色譜峰的出峰時(shí)間和峰型沒有明顯變化，實(shí)驗(yàn)室的室溫接近25 ℃，故選擇柱溫為25 ℃（圖2）。流速過快，出峰的時(shí)間較早，與溶劑干擾峰比較接近，流速過慢，出峰時(shí)間過晚，影響實(shí)驗(yàn)效率，故確定流速為0.7 mL/min（圖3）。本試驗(yàn)的色譜條件為流動(dòng)相：0.05%草酸-甲醇（98∶2）；柱溫：25 ℃；流速：0.7 mL/min。

圖1 不同流動(dòng)相水相濃度樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of water concentration in different mobile phases

圖2 不同流速樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of samples with different flow rates

圖3 不同柱溫樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of samples with different column temperatures

2.2 耐用性試驗(yàn)

本試驗(yàn)所優(yōu)化的刺梨抗壞血酸的測定方法在色譜柱型號(hào)發(fā)生改變后，測定出的峰面積沒有受到明顯的影響，表明試驗(yàn)優(yōu)化的抗壞血酸檢測方法對可變試驗(yàn)因素的抗干擾能力較強(qiáng)。

2.3 專屬性試驗(yàn)

對照品溶液、供試品溶液的高效液相色譜中抗壞血酸理論塔板數(shù)（N）分別是24 002.7、22 208.6，供試品溶液中抗壞血酸色譜峰分離較好，峰形對稱，并且陰性無干擾，如圖4、5（見下頁）。該方法專屬性良好。

圖4 對照品HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of reference substance

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

刺梨抗壞血酸在0～50 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，回歸方程：y=96.094x-2.958，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Durability test results

表3 對照品、供試品溶液抗壞血酸理論塔板數(shù)Table 3 Theoretical plate number of ascorbic acid solution of reference substance and test substance

圖5 樣品HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of the sample

2.5 精密度試驗(yàn)

測得對照品中抗壞血酸平均峰面積為960.28，RSD為0.406%，表明該方法測定結(jié)果的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

測得供試品溶液中抗壞血酸平均峰面積為605.95，RSD為1.001%，表明供試品溶液在3 h 內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

測得供試品溶液中抗壞血酸平均峰面積為1 217.97，RSD為0.486%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.8 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)中，抗壞血酸添加量為已知樣品中抗壞血酸含量的80%，平均回收率為101.38%，RSD為0.64%；添加量為已知樣品含量的100%，平均回收率為99.44%，RSD為0.53%；添加量為已知樣品含量的120%，平均回收率為99.06%，RSD值為0.21%?；厥章瘦^好。

2.9 兩種方法測定貴州省刺梨中抗壞血酸含量結(jié)果比較

使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，配對樣本T 檢驗(yàn)分析，P＞0.05，按α=0.05 水準(zhǔn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為試驗(yàn)優(yōu)化的測定方法刺梨中抗壞血酸的含量與GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”中第一法HPLC 測定刺梨中抗壞血酸含量兩者無明顯差異（表4）。

表4 兩種方法測定刺梨中抗壞血酸含量結(jié)果比較Table 4 Comparison of ascorbic acid content in roxburgh determined by two methods

3 討論

GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”中記載了3 種檢測抗壞血酸含量的方法，分別為高效液相色譜法、熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法[12]。熒光法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定，但大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，需進(jìn)行前處理，操作步驟復(fù)雜，試劑和樣品溶液穩(wěn)定性差，且某些果膠含量高的樣品不易處理。操作過程中使用的活性炭，雖然可將抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，但其有吸附抗壞血酸的作用，影響抗壞血酸含量的測定，且由于影響熒光強(qiáng)度的因素較多，大批量檢測時(shí)，測定條件很難完全再現(xiàn)，易造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確性[13-14]。2,6-二氯靛酚滴定法成本低、方法簡便，但不能直接測定樣品中脫氫抗壞血酸及結(jié)合抗壞血酸的含量，易受其他還原物質(zhì)的干擾。且若樣品中含有大量色素類物質(zhì)，致使抗壞血酸提取液顏色過深，會(huì)增大實(shí)驗(yàn)誤差[15-16]。高效液相色譜法檢測食品中抗壞血酸含量較熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法的靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性良好，測定結(jié)果準(zhǔn)確。而GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”中第一法HPLC 測定食品中抗壞血酸含量，所使用的試劑、配制方法以及實(shí)驗(yàn)步驟均較復(fù)雜，如流動(dòng)相水相的配制采用6.8 g 磷酸二氫鉀和0.91 g 十六烷基三甲基溴化銨進(jìn)行配制，標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及供試品溶液的配制需使用20 g/L 的偏磷酸溶液進(jìn)行定容，同時(shí)在試樣溶液還原過程中，還需磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至2.5～2.8。復(fù)雜的操作步驟，可能增加試驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確，且抗壞血酸久置不穩(wěn)定、易氧化，故本試驗(yàn)對HPLC 測定方法進(jìn)行了優(yōu)化，以簡化試驗(yàn)操作過程，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

優(yōu)化得貴州省刺梨中抗壞血酸HPLC 含量測定方法為：色譜柱：資生堂C184.6 mml.D×250 mm；柱溫：25 ℃；檢測波長為245 nm；流動(dòng)相為0.05%草酸水溶液-甲醇（98∶2）；進(jìn)樣量20 μL；流速：0.7 mL/min。

試驗(yàn)優(yōu)化方法所測結(jié)果與GB 5009.86—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中抗壞血酸的測定”中第一法高效液相色譜法檢測結(jié)果無差異，即所得優(yōu)化HPLC 方法用以測定貴州省刺梨中抗壞血酸含量操作簡便、快捷、準(zhǔn)確，且靈敏度高，分離度好，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性較好。