基于HPLC多指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的小兒康顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

王紫潔，馬靈珍

0 引言

小兒康顆粒由太子參、山楂、白芍、白術(shù)、茯苓等12味中藥材按照“君、臣、佐、使”中醫(yī)藥理論配伍而成，主要用于食滯蟲(chóng)痢、煩躁不安、精神疲倦、脘腹脹滿、面色萎黃等病癥的治療[1]。現(xiàn)代藥理和臨床研究表明，小兒康顆粒可有效改善功能性腹痛[2]、再發(fā)性腹痛[3]的臨床癥狀，對(duì)小兒腹瀉[4]、小兒功能性便秘[5]治療效果顯著，同時(shí)還具有增強(qiáng)小兒厭食癥患者食欲[6]、降低高血鉛和輕度鉛中毒患兒的血鉛水平[7]等作用。小兒康顆粒現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第六冊(cè)[1]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未對(duì)其所含成分進(jìn)行定量控制，文獻(xiàn)報(bào)道[8]中也僅對(duì)其佐藥白芍所含的芍藥苷進(jìn)行了定量研究。中藥及其制劑所含成分繁多且復(fù)雜，具有多靶點(diǎn)、多組分協(xié)同增效、多點(diǎn)微調(diào)等特點(diǎn)，為全面評(píng)價(jià)中成藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于其質(zhì)量控制中。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)配伍理論，結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，采用HPLC梯度洗脫法對(duì)小兒康顆粒中君藥太子參的主要活性成分太子參環(huán)肽B，臣藥山楂的代表性成分牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷，佐藥白芍的代表性成分氧化芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的小兒康顆粒目標(biāo)成分含量進(jìn)行聚類分析和主成分分析，為全面評(píng)價(jià)小兒康顆粒整體質(zhì)量、提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；AE240型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-201943，含量95.1%，CAS號(hào)23180-57-6)、金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào):111521-201809，含量94.9%，CAS號(hào)482-36-0)和牡荊素葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào):111979-201501，含量92.8%，CAS號(hào)178468-00-3)均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品(批號(hào):16042941，含量98.1%，CAS號(hào)64820-99-1)、氧化芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):18031641，含量98.8%，CAS號(hào):39011-91-1)、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):18031622，含量99.3%，CAS號(hào)38642-49-8)和太子參環(huán)肽B對(duì)照品(批號(hào):18031328，含量99.9%，CAS號(hào)145459-19-4)均來(lái)源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。小兒康顆粒(規(guī)格：每袋裝10 g；批號(hào)：190303、190305、190801，編號(hào)依次為S1～S3，來(lái)源于海南葫蘆娃藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，簡(jiǎn)稱企業(yè)1；批號(hào)：7381902、7382201、7382401、7382801、8381802、8382203、8382501，編號(hào)依次為S4～S10，來(lái)源于廣州諾金制藥有限公司，簡(jiǎn)稱企業(yè)2；批號(hào)：1902002、200101，編號(hào)依次為S11～S12，來(lái)源于江西佑美制藥有限公司，簡(jiǎn)稱企業(yè)3)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B對(duì)照品適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.436、3.178、0.544、0.278、2.536、0.192、0.158 mg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和2.5 ml，分別置于6個(gè)20 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成6個(gè)系列質(zhì)量濃度線性考察混對(duì)溶液Ⅰ～Ⅵ；取混對(duì)溶液Ⅳ作為混合對(duì)照品溶液(牡荊素葡萄糖苷21.8 μg/ml、牡荊素鼠李糖苷158.9 μg/ml、金絲桃苷27.2 μg/ml、氧化芍藥苷13.9 μg/ml、芍藥苷126.8 μg/ml、苯甲酰芍藥苷9.6 μg/ml、太子參環(huán)肽B 7.9 μg/ml)。

2.1.3 供試品溶液和陰性樣品溶液 取小兒康顆粒樣品適量，除去內(nèi)包裝，取內(nèi)容物研成細(xì)粉，取約2.0 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理45 min，放冷后用甲醇補(bǔ)重，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，制成小兒康顆粒供試品溶液。按小兒康顆粒的處方工藝[1]，分別制備缺山楂、缺白芍和缺太子參的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗(yàn) 以Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為液相色譜柱，柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～14.0 min，15.0%A；14.0～25.0 min，15.0%A→27.0%A；25.0～41.0 min，27.0%A→39.0%A；41.0～47.0 min，39.0%A→52.0%A；47.0～55.0 min，52.0%A→15.0%A)，流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為340 nm (0～25.0 min檢測(cè)牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷)[9-11]，230 nm (25.0～41.0 min檢測(cè)氧化芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷)[12-14]和203 nm (41.0～55.0 min檢測(cè)太子參環(huán)肽B)[15-17]。精密吸取混合對(duì)照品溶液、小兒康顆粒供試品溶液和各陰性樣品溶液各10 μl，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果小兒康顆粒供試品色譜圖中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B色譜峰峰形對(duì)稱，分離度均>1.5，理論板數(shù)按各目標(biāo)化合物色譜峰計(jì)均≥3 500，陰性樣品對(duì)小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分的測(cè)定不干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度線性考察混對(duì)溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μl，依次進(jìn)樣測(cè)定小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)化合物的峰面積，以牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B質(zhì)量濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得7種成分的回歸方程、線性范圍及r值見(jiàn)表1。

表1 7種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察

2.4.1 精密度考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，結(jié)果儀器精密度良好，太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分峰面積的RSD分別為1.05%、0.52%、1.06%、1.09%、0.57%、1.10%和1.22%。

2.4.2 重復(fù)性考察 取小兒康顆粒樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法配制6份小兒康顆粒供試品溶液，依法進(jìn)樣分析，記錄牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積并計(jì)算各目標(biāo)化合物的含量，結(jié)果方法重復(fù)性良好，太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分含量的RSD分別為1.82%、0.86%、1.61%、0.73%、1.08%、1.75%和1.89%。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 臨用新配1份小兒康顆粒供試品溶液，于0、2、4、8、18和24 h進(jìn)樣檢測(cè)牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，結(jié)果小兒康顆粒供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分峰面積的RSD分別為0.99%、0.56%、1.07%、1.12%、0.60%、1.15%和1.18%。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量均已知的同一批次小兒康顆粒樣品適量，除去內(nèi)包裝取內(nèi)容物研成細(xì)粉，取約1.0 g，精密稱定(共稱取9份，3份隨機(jī)分為1組)，依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定(對(duì)照品加入量約為樣品原有量的50%、100%和150%)，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(另行配制，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的質(zhì)量濃度分別為0.127、0.863、0.159、0.078、0.715、0.057、0.043 mg/ml)1.0、2.0和3.0 ml，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，并計(jì)算其含量，用測(cè)得量與樣品原有量之差除以對(duì)照品加入量，計(jì)算太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分的回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 小兒康顆粒中7種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

2.6 樣品含量測(cè)定 取12個(gè)批次的小兒康顆粒樣品(編號(hào)S1～S12)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液(每個(gè)批次平行制備3份)，依法進(jìn)樣測(cè)定牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，并計(jì)算目標(biāo)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

2.7 聚類分析 為考察不同批次小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分的含量差異，采用SPSS 26.0軟件系統(tǒng)聚類分析法(聚類方法：組間聯(lián)接，測(cè)度：歐氏距離)對(duì)12個(gè)批次小兒康顆粒樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2所得結(jié)果可知，當(dāng)類間距離為15時(shí)，12批小兒康顆粒樣品聚為3類，樣品S6、S10、S5、S7、S9、S4和S8聚為一類，樣品S11和S12聚為一類，樣品S1、S3和S2聚為一類。從分類結(jié)果可以看出，同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的小兒康顆粒樣品聚為一類，表明同一生產(chǎn)企業(yè)樣品各成分含量相對(duì)穩(wěn)定、均勻，企業(yè)2樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定，而不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定差異。

圖2 12批小兒康顆粒聚類分析樹(shù)狀圖

2.8 主成分分析 采用SPSS 26.0軟件對(duì)12批小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，將表3測(cè)得數(shù)值導(dǎo)入分析軟件，得樣品主成分分析碎石圖見(jiàn)圖3，主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖3 主成分分析碎石圖

根據(jù)累積貢獻(xiàn)率>85%的原則，以初始特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，前3個(gè)主成分分別為3.219、1.461、1.282，初始特征值均>1，對(duì)方差貢獻(xiàn)率分別為45.987%、20.869%和18.312%，累積貢獻(xiàn)率為85.168%，大于85%，表明提取前3個(gè)主成分即可代表小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分85.168%的信息，可以用于對(duì)小兒康顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3 討論

3.1 多指標(biāo)成分的選擇 小兒康顆粒由太子參、山楂、白芍、白術(shù)、茯苓等12味中藥材組方而來(lái)，方中太子參益氣健脾、生津潤(rùn)肺，白術(shù)健脾益氣、燥濕利水，共為君藥；山楂消食健胃、化濁降脂，茯苓健脾滲濕，葫蘆茶消痰散瘀，麥芽行氣消食、健脾開(kāi)胃，合為臣藥；白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛，烏梅斂肺生津，蟬蛻斂肺止痛，榧子消積潤(rùn)肺、潤(rùn)燥通便，檳榔行氣消積，合為佐藥；陳皮健脾和胃、行氣寬中，引藥達(dá)病所，為使藥。諸藥合用，共奏健脾開(kāi)胃、消食化滯、驅(qū)蟲(chóng)止痛之功。太子參環(huán)肽B為君藥太子參特征成分；牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷等黃酮類為臣藥山楂主要活性成分；氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等單萜類化合物為佐藥白芍主要藥效成分。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則選取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B為小兒康顆粒多指標(biāo)定量測(cè)定成分，以期全面評(píng)價(jià)小兒康顆粒的整體質(zhì)量。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化 在確定供試品溶液制備方法時(shí)，以小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的綜合提取率為指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合雜質(zhì)干擾程度，對(duì)比考察了50%甲醇[11]、70%甲醇[9]、甲醇[13,15-17]和50%乙醇[12,14]提取溶劑以及超聲提取[9-11,13-17]、加熱回流[12]提取方式對(duì)考察指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示，以甲醇超聲提取時(shí)，小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)成分干擾較小，在此基礎(chǔ)上對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終確定采用甲醇超聲提取45 min對(duì)小兒康顆粒進(jìn)行供試品溶液的制備。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化選擇 在流動(dòng)相優(yōu)化選擇時(shí)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，依次考察了乙腈-水[15,17]、乙腈-0.1%甲酸溶液[10-11,16]和乙腈-0.1%磷酸溶液[12-14]流動(dòng)相體系對(duì)小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B色譜峰峰形、分離度的影響。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜圖基線平穩(wěn)，太子參環(huán)肽B等7種目標(biāo)成分色譜峰峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰均能有效分離。在此基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相中有機(jī)相和水相比例進(jìn)行優(yōu)化，最終確定采用“2.2”項(xiàng)色譜條件下的流動(dòng)相梯度洗脫程序?qū)π嚎殿w粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，建立了該制劑的多指標(biāo)成分質(zhì)量控制評(píng)價(jià)模式，所建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，為全面評(píng)價(jià)小兒康顆粒的整體質(zhì)量提供了參考依據(jù)，同時(shí)采用聚類分析、主成分分析對(duì)3個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的12批次小兒康顆粒樣品質(zhì)量進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，同一生產(chǎn)企業(yè)樣品相對(duì)穩(wěn)定，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定差異，可能與各生產(chǎn)企業(yè)原藥材質(zhì)量控制和生產(chǎn)過(guò)程參數(shù)控制存在一定差異有關(guān)，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等源頭控制，不斷提升原藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化制劑生產(chǎn)過(guò)程控制參數(shù)，確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的一致性。