辣木籽對(duì)酒精和四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

張 蕾 ， 王璐瑤 ， 秦心寧 ， 郝婧瑋 ， 李金旭 ， 陳 研 ， 肖婷婷 ， 吳禹歧

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ， 黑龍江 牡丹江 157011)

辣木(Moringa) 為多年生的熱帶落葉喬木，產(chǎn)自印度，因?yàn)槠涓哂行晾蔽抖么嗣＠蹦镜母⑶o、葉、花、種子都含有豐富的藥用和營(yíng)養(yǎng)成分，是優(yōu)質(zhì)的保健食品原料[1-2]。辣木種子部分叫作辣木籽，研究表明，辣木籽具有降血糖、抗腫瘤、抗菌、清除自由基等功能[3-8]，但是對(duì)于其在肝臟損傷方面的研究還未有報(bào)道。本試驗(yàn)利用酒精和四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)小鼠建立肝臟損傷模型，研究辣木籽對(duì)模型小鼠肝損傷的影響，為探索辣木籽在臨床上治療肝損傷方面疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)，由黑龍江省齊齊哈爾市查陽(yáng)醫(yī)院進(jìn)行檢測(cè)；乙醇、亞丙醇、CCl4，均購(gòu)自北京化工廠；紅星二鍋頭(52°)，購(gòu)自北京紅星股份有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(美國(guó) R & D公司)。

1.2 肝損傷小鼠模型的建立 隨機(jī)選取90只雄性、健康的昆明小鼠，正常適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，分為正常組(作為對(duì)照)、酒精性肝損傷組(包括模型組、低劑量組、高劑量組和維生素E組)、CCl4肝損傷組(包括模型組、低劑量組、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組)，每組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。

酒精性肝臟損傷模型的建立：將小鼠隨機(jī)分籠，分為模型組、低劑量組[灌胃給藥辣木籽100 mg/(kg·bw)]、高劑量組[灌胃給藥辣木籽200 mg/(kg·bw )]、陽(yáng)性給藥組[維生素E 組，灌胃維生素E 80 mg/(kg·bw)]，每組10只，連續(xù)灌胃給藥20 d，模型組灌胃等量的生理鹽水，在最后1次灌胃給藥2 h后，酒精性肝損傷各組均一次性給予灌胃56°紅星二鍋頭15 mL/(kg·bw)。小鼠在末次灌胃給藥后禁食不禁水。

CCl4急性肝損傷小鼠模型的建立：將小鼠隨機(jī)分籠，分為模型組、低劑量組[灌胃給藥辣木籽100 mg/(kg·bw)]、 高劑量組[灌胃給藥辣木籽200 mg/(kg·bw )]、陽(yáng)性給藥組[聯(lián)苯雙酯組，灌胃給藥聯(lián)苯雙酯組100 mg/(kg·bw)]，每組10只，連續(xù)灌胃給藥20 d，模型組灌胃等量的生理鹽水，最后1次 灌胃給藥2 h后，給小鼠注射10 mL/(kg·bw)的 0.1%CCl4花生油溶液。小鼠在末次給藥后禁食不禁水。

1.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 灌胃給藥20 d后采取眼眶取血的方法，血樣靜置30 min后，4 000 r/min離心10 min， 取血清并采用試劑盒法檢測(cè)AST、ALT、ALP和TNF-α。

1.4 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 小鼠處死后，立即取肝組織，經(jīng)固定液固定后，通過(guò)H.E.染色觀察各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用GraphPad Prism 5和SPSS 13.0軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辣木籽對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的影響

2.1.1 辣木籽對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷肝指數(shù)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1。正常組小鼠每日飲水量正常，尿量正常，體重持續(xù)增加，皮膚光亮，活動(dòng)靈活。模型組小鼠狀態(tài)較差，皮毛干燥，精神萎靡不振。和模型組相比，辣木籽高劑量組小鼠狀態(tài)明顯改善。與正常組小鼠相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.01)。與模型組小鼠相比較，辣木籽組和維生素E組小鼠的肝臟指數(shù)有明顯的降低(P<0.01)。 這些結(jié)果說(shuō)明辣木籽對(duì)酒精引起的肝腫脹現(xiàn)象具有一定的緩解作用。

圖1 辣木籽對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷肝臟指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Moringa seeds on liver index in mice with alcohol-induced acute liver injury與正常組比較， **：P<0.01； 與模型組比較， ▲：P<0.05， ▲▲：P<0.01； 下圖同Compare to normal group， **：P<0.01. Compare to model group，▲：P<0.05， ▲▲：P<0.01.The same as below

2.1.2 辣木籽對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清中AST、ALT和ALP水平的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清中AST、ALT和ALP的水平明顯升高(P<0.01)，分別達(dá)到了(150.85±1.25)U/L、(165.35±3.21)U/L和(126.25±3.37)U/L。辣木籽低劑量組小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分別為(102.20±1.83)U/L、(96.63±1.73)U/L和(96.63±1.73)U/L，與模型組小鼠相比，具有顯著性(P<0.05)；辣木籽高劑量組小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分別(60.50±3.00)U/L、(73.20±2.40)U/L和(52.30±1.50)U/L，與模型組小鼠相比顯著降低(P<0.01)，維生素E組和模型組相比下降也很明顯(P<0.01)，甚至和正常組相差不多。隨著辣木籽給藥量的提高，小鼠血清中AST、ALT和ALP水平明顯升高，且具有劑量依賴性。

表1 辣木籽對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷血液指數(shù)的影響Table 1 Effects of Moringa seeds on blood index in mice with alcohol-induced acute liver injury

2.1.3 辣木籽對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清中TNF-α的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2。TNF-α是在體內(nèi)腫瘤組織中殺傷某些腫瘤細(xì)胞或引起血液壞死的因子。與正常小鼠相比，模型組小鼠的TNF-α水平顯著增加 (P<0.01)。與模型組小鼠相比，辣木籽給藥組和維生素E組小鼠TNF-α水平均有不同程度的下降，其中高劑量組和維生素E組下降較明顯(P<0.01)。這些結(jié)果說(shuō)明了辣木籽可以改善肝損傷時(shí)的炎癥程度。

圖2 酒精性急性肝損傷小鼠血清中腫瘤壞死因子-α含量Fig.2 The TNF-α content in mice with alcohol-induced acute liver injury

2.1.4 辣木籽對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響 H.E.染色后，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常組小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞排列整齊，肝索中中央靜脈清晰可見(jiàn)。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象很明顯。和模型組相比，辣木籽低劑量組和維生素E組小鼠肝細(xì)胞損壞程度有所改善，但肝小葉結(jié)構(gòu)仍然混亂；辣木籽高劑量組和維生素E組肝細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯改善，肝細(xì)胞損傷程度較輕，肝細(xì)胞排列較整齊(中插彩版圖3)。

圖3 酒精誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝組織形態(tài) (40×)Fig.3 Pathological changes of liver tissue in mice with alcohol-induced acute liver injury (40×)A：正常組； B：模型組； C：低劑量組； D：高劑量組； E：維生素E組A：Normal group; B：Model group; C：Low-dose group; D：High-dose group; E：Vitamin E group

2.2 辣木籽對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的影響

2.2.1 辣木籽對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷肝臟指數(shù)的影響 正常組小鼠每日飲水量正常，尿量正常，體重持續(xù)增加，皮膚光亮，活動(dòng)靈活，相比較來(lái)看模型組小鼠狀態(tài)較差，皮毛干燥，精神萎靡不振；和模型組相比，辣木籽高劑量組小鼠狀態(tài)明顯改善。如圖4所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.01)，這表明CCl4引起小鼠肝臟顯著增加。與模型組相比，辣木籽組和聯(lián)苯給藥組小鼠的肝臟指數(shù)顯著降低，這些結(jié)果說(shuō)明辣木籽對(duì) CCl4引起的肝腫脹現(xiàn)象具有一定的緩解作用。

圖4 辣木籽對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷肝臟指數(shù)的影響Fig.4 Effect of Moringa seeds on liver index in mice with CCl4-induced acute liver injury

2.2.2 辣木籽對(duì)小鼠血清中AST、ALT和ALP水平的影響 (見(jiàn)表2)。與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清中AST、ALT和ALP的活性明顯升高(P<0.01)，分別達(dá)到了(138.30±3.60)U/L、(147.90±2.93)U/L和(117.60±0.98)U/L。辣木籽低劑量組小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分別為(92.10±0.78)U/L、(116.50±1.73)U/L和(89.60±3.73)U/L，與模型組小鼠相比差異顯著(P<0.5)；辣木籽高劑量組小鼠血清中AST、ALT和ALP的含量分別(114.35±2.31)U/L、(126.34±3.27)U/L和(92.83 ±2.51)U/L，與模型組小鼠相比顯著降低(P<0.01)，聯(lián)苯雙酯組和模型組相比下降也很明顯(P<0.01)，甚至和正常組相比差不多。隨著辣木籽給藥量的提高，小鼠血清中AST、ALT和ALP水平明顯升高，具有劑量依賴性。

表2 辣木籽對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠血液指數(shù)的影響Table 2 Effects of Moringa seeds on blood index in mice with CCl4- induced acute liver injury

2.2.3 辣木籽對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清中TNF-α的影響 腫瘤壞死因子(TNF-α)是在體內(nèi)腫瘤組織中殺傷某些腫瘤細(xì)胞或引起血液壞死的因子。與正常小鼠相比，模型組小鼠的TNF-α水平顯著增加 (P<0.01)。與模型組小鼠相比，辣木籽組和聯(lián)苯雙酯組小鼠TNF-α水平均有不同程度的下降，其中高劑量組和聯(lián)苯雙酯組下降較明顯(P<0.01) (圖5)。這些結(jié)果說(shuō)明了辣木籽可以改善肝損傷時(shí)的炎癥程度。

圖5 CCl4急性肝損傷小鼠血清腫瘤壞死因子-αFig.5 The TNF-α content in mice with CCl4-induced acute liver injury

2.2.4 辣木籽對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響 H.E.染色發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核和肝索中中央靜脈清晰可見(jiàn)。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯。和模型組相比，辣木籽低、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細(xì)胞損壞程度有所改善，肝細(xì)胞排列較整齊(中插彩版圖6)。

圖6 CCl4急性肝損傷小鼠肝組織病理變化 (40×)Fig.6 Pathological changes of liver tissue in mice with CCl4-induced acute liver injury (40×)A：正常組； B：模型組； C：低劑量組； D：高劑量組； E：維生素E組A：Normal group; B：Model group; C：Low-dose group; D：High-dose group; E：Vitamin E group

3 討論

肝損傷是一種常見(jiàn)臨床疾病，嚴(yán)重危害人類的身體健康，它是指肝臟受到外部因素的侵襲而受到的損傷，可分為病理性的肝損傷和化學(xué)性的肝損傷。酒精性肝臟損傷(ALD)是指大量或長(zhǎng)期飲用含酒精飲品引起的肝臟疾病，是肝硬化疾病的常見(jiàn)病因。近年來(lái)，酒精性肝損傷的發(fā)生率明顯增加，引起了醫(yī)學(xué)界和社會(huì)的廣泛關(guān)注。急性酒精性的肝損傷的機(jī)制是乙醇被人體吸收，在乙醇脫氫酶和脫氫醋酸乙醛的催化下，產(chǎn)生活性的氧自由基，導(dǎo)致由肝細(xì)胞損傷引起的肝臟細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用[9]，乙醇進(jìn)一步氧化成乙酸，最后進(jìn)入線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)(Krebs)循環(huán)被完全氧化成CO2和H2O，釋放能量[10]。該過(guò)程使輔酶連續(xù)轉(zhuǎn)化為還原型輔酶，當(dāng)其比例變化，會(huì)抑制Krebs循環(huán)，脂肪的氧化減弱,使肝內(nèi)的脂肪酸增多[11]，酒精性肝損傷可以使血清內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶升高，使肝細(xì)胞變性、水腫、壞死[12]等。

CCl4肝損傷的機(jī)制與CCl4自身及其自由基的代謝產(chǎn)物有關(guān)。當(dāng)CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，其最終代謝成氧自由基自由基團(tuán)-CCl3O2和2-三氯甲基(CCl3)。這個(gè)過(guò)程需消耗大量的抗氧化劑，可導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激是CCl4誘導(dǎo)肝損傷的重要環(huán)節(jié)[13]。血清ALT、AST和ALP水平的增加歸因于肝臟結(jié)構(gòu)受損[14]。通常可以通過(guò)分析血清ALT、AST和ALP水平來(lái)確定細(xì)胞死亡。在本試驗(yàn)中與模型組的小鼠相比，100 mg/(kg·bw)和200 mg/(kg·bw)辣木籽組小鼠血清中的ALT、ALP、AST含量明顯降低，且呈劑量依賴性。

腫瘤壞死因子是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的單核細(xì)胞因子，在肝臟損傷的過(guò)程中起重要作用[15-16]。研究表明，腫瘤壞死因子是由核因子κB(NF-κB)監(jiān)管,并增加其釋放促進(jìn)NF-κB的磷酸化，而使NF-κB激活，通過(guò)持續(xù)的復(fù)雜循環(huán)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[17]。同時(shí)，腫瘤壞死因子作為肝臟損傷的第一介質(zhì)，即使有少量的腫瘤壞死因子存在，也會(huì)發(fā)生組織的損傷[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的TNF-α水平顯著增加，辣木籽組和陽(yáng)性給藥組小鼠的TNF-α水平下降較明顯，說(shuō)明辣木籽對(duì)CCl4和酒精所導(dǎo)致小鼠急性肝損傷有改善作用，其作用機(jī)制可能和減輕炎癥因子有關(guān)。

本試驗(yàn)為辣木籽在臨床上治療肝損傷的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，證實(shí)辣木籽對(duì)CCl4和酒精所致的急性肝損傷有緩解作用，但其相關(guān)的副作用也需進(jìn)一步探討研究。