固相萃取光譜法測定水及肉制品中痕量亞硝酸鈉

李超逸，李 龍，朱 瑩，吳 婷，杜一平*

（華東理工大學 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237）

硝酸鹽與亞硝酸鈉是常見的含氮化合物，廣泛存在于人類生活環境中。人體內硝酸鹽在微生物作用下可還原成亞硝酸鈉，是N-亞硝基化合物的前體物質。亞硝酸鈉的外觀及滋味都與食鹽相似，并在工業、建筑業中廣為使用，在肉類制品中也允許作為發色劑限量使用。但是由亞硝酸鈉引起食物中毒的機率較高。食入0.3～0.5 g的亞硝酸鈉即可引起中毒，3 g可導致死亡[1]。GB 8537—2008《飲用天然礦泉水》規定了飲用天然礦泉水中亞硝酸鈉質量濃度不得超過0.1 mg/L[2]。在食品工業中NO2－的添加量過多存在很大的食品安全問題[3-5]。攝入過量的亞硝酸鈉能使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，因而失去攜氧能力而引起組織缺氧。同時，亞硝酸鈉還是一種致癌物質，在胃酸環境下亞硝酸鈉與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反應生成強致癌物N-亞硝胺。

目前亞硝酸鈉的常用測定方法有離子色譜法、紫外分光光度法和可見分光光度法[6-12]。離子色譜法定量準確，但需要較昂貴的大型儀器，而且分析時間較長，不適用于快速、現場分析。紫外分光光度法雖然操作簡單、分析速度快，但是靈敏度不高，容易受到其他物質的干擾。可見分光光度法雖然具有紫外光譜同樣的優點，并且經過了衍生化試劑的衍生化，提高了抗干擾的能力，但是靈敏度依然不高。在GB 8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》[13]中飲用天然礦泉水規定了亞硝酸鈉的標準檢測方法為鹽酸萘乙二胺分光光度法。亞硝酸鈉與對氨基苯磺酸定量反應生成重氮鹽，而重氮鹽會與鹽酸萘乙二胺發生偶聯，反應產物呈紫紅色，可用于亞硝酸鈉的定量分析[14]。該方法適用于微量亞硝酸鈉的檢測，但達不到痕量亞硝酸鈉的檢測要求。本課題組曾開發了膜富集-在線漫反射光譜檢測的裝置和分析方法，稱為固相萃取光譜（solid phase extraction spectroscopy，SPES）技術。該技術在被測組分富集后不經洗脫而在固相材料上直接測定固相光譜，方法簡單、快速、靈敏，選擇性往往也能得到提高[15-21]。本實驗采用SPES技術，對亞硝酸鈉的衍生產物富集后直接進行漫反射可見光譜的檢測，大幅提高了檢測方法的靈敏度，實現痕量亞硝酸鈉含量的快速測定；所建立方法具備快速、便捷，儀器結構簡單、操作方便、價格低廉的特點，適用于水質以及肉制品中亞硝酸鈉離子的快速檢測和現場檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美式培根和雙匯培根 市購。

尼龍膜（Nylon-A）（孔徑0.22 μm） 北京海成世潔過濾器材有限公司；混合纖維素膜（mixed cellulose ester，MCE）、尼龍膜（Nylon-B）、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）、醋酸纖維素膜（cellulose acetate，CA）（孔徑0.22 μm） 上海興亞凈化材料廠。

對氨基苯磺酸、氫氧化鈉、三水合醋酸鈉、冰醋酸（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技有限公司；亞硝酸鈉、1-萘酚、濃鹽酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

量筒式過濾器 天津津騰實驗設備有限公司；PHS-25型數字型精密酸度計、AB104-N電子天平Mettler-Toledo（上海）儀器公司；超純水凈化系統（≥18.2 MΩ?cm） 德國Sartorius公司；超聲波清洗器上海聲彥超聲儀有限公司；90-1型恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器公司；SHB-Ш循環水真空泵 上海衛凱儀器設備有限公司。

SPES采集系統由實驗室自行搭建，部件包括：上海津騰實驗設備有限公司的量筒式過濾器、BWTEK BIP2.0積分球、OCEAN-HDX-UV-VIS檢測器（200～800 nm）、分辨率0.73、海洋光學紫外-可見光譜儀（帶光纖）。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

GB 8538—2016規定了鹽酸萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鈉，反應產物為4-((4-(2-氨基乙基氨基)萘-1-基)二氮烯基)苯磺酸二鹽酸鹽，研究發現該偶氮化合物難以在微孔濾膜上富集，達不到SPES的要求。為此，本實驗用1-萘酚代替鹽酸萘乙二胺。先使用對氨基苯磺酸在酸性條件下與亞硝酸鈉反應生成重氮鹽（圖1 1a），再與1-萘酚反應生成偶氮化合物[22]（圖1 2a和2b），反應方程如圖1所示。反應后的溶液過尼龍膜，尼龍膜截取偶氮化合物形成橘黃色色斑，干燥后直接對膜上的色斑進行漫反射可見光譜的測定。

圖1 亞硝酸鈉衍生化原理圖Fig.1 Schematic diagram of sodium nitrite derivatization

1.3.2 標準方法

取10 mL一定質量濃度的亞硝酸鈉溶液，根據比例加入對氨基苯磺酸，攪拌5 min后，按比例加入1-萘酚和緩沖溶液，攪拌15 min過后將溶液轉移進100 mL容量瓶，加入緩沖溶液定容。取10 mL溶液，在尼龍膜固相萃取裝置[15]上進行過濾，獲得橘黃色的色斑，平行實驗3 次，室溫下自然風干干燥約40 min至無水分殘留，采集濾膜色斑的可見光譜，用472.5 nm波長處吸光度與亞硝酸鈉質量濃度建立標準曲線。

1.3.3 自來水中亞硝酸鈉檢測

取10 mL自來水（pH 4.3），加入不同體積的亞硝酸鈉標準溶液，根據比例加入對氨基苯磺酸，攪拌5 min后，按比例加入1-萘酚和緩沖溶液，攪拌15 min后將溶液轉移進100 mL容量瓶，加入緩沖溶液定容進行加標回收實驗。取10 mL溶液，按上述方法進行光譜測定。

1.3.4 實際樣品中亞硝酸鈉檢測

取2.5 g肉制品攪碎至肉糜，用60～70 ℃ 100 mL超純水溶解并轉移進250 mL容量瓶，沸水浴煮沸20 min，冷卻至室溫定容，分別使用0.1 μm的微孔濾膜和C18-SPE小柱進行處理得到肉制品提取液。取提取液5 mL，根據比例加入衍生化試劑和緩沖溶液，稀釋至50 mL，按上述方法進行衍生化反應和光譜測定；離子色譜的對照實驗也是使用該方法下獲得的肉制品提取液直接進行分析。

2 結果與分析

2.1 衍生化反應產物的表征

對于衍生化產物，采用基質輔助激光解析-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）對其分子質量進行確定（圖2），并用拉曼光譜對—N＝N—偶氮化合物骨架進行驗證（圖3）。質譜圖中m/z327.1的譜峰，由于在負離子模式下，磺酸基的氫離子容易失去，與目標偶氮化合物2a或2b的分子質量（328.1 Da）相符；拉曼光譜中1 455.55 cm－1峰為—N＝N—骨架的特征峰[23]，該峰對應的偶氮化合物可能具有對位（2a）或鄰位（2b）的取代結構。

圖2 偶氮化合物的MALDI-TOF MS圖Fig.2 MALDI-TOF MS of azo compounds

圖3 偶氮化合物的拉曼光譜Fig.3 Raman spectrum of azo compounds

2.2 衍生化反應條件的優化

2.2.1 偶氮化合物溶液pH值的選擇

pH值對偶氮化合物的結構以及合成有很大的影響[24-25]，酸性條件下1-萘酚上羥基的氫不易脫落，溶液呈現橙紅色；堿性條件下羥基上的氫容易失去形成氧負離子，與萘環的大共軛π鍵相互作用，溶液呈現玫紅色，同時堿性條件下的產物較復雜，副產物較多。因此，pH值的影響結果如圖4所示，在pH 4.74時，膜上偶氮化合物獲得最大的吸光度，后續選擇pH 4.74的緩沖體系進行實驗。

圖4 樣品溶液pH值對偶氮化合物吸光度的影響（472.5 nm）Fig.4 Effect of pH on absorbance at 472.5 nm of azo compounds

2.2.2 反應時間的選擇

亞硝酸鈉和對氨基苯磺酸的重氮反應較為快速，常溫下2～8 min即可反應完全[9]；但重氮鹽和1-萘酚的反應程度則和反應時間有關。因此，設計實驗考察3 個質量濃度的待測液，從加入衍生化試劑及緩沖溶液后開始實時監測溶液的吸光度，從而獲得反應時間對吸光度的影響，平行3 次，如圖5所示，隨著反應時間延長，溶液吸光度逐步增高，到15 min吸光度恒定不變。后續實驗中第2步反應時間選擇15 min。

圖5 反應時間對偶氮反應的影響（472.5 nm）Fig.5 Effect of reaction time on absorbance at 472.5 nm of azo compounds

2.2.3 衍生化試劑用量比例的確定

參考文獻[26]中亞硝酸鈉-對氨基苯磺酸-1-萘酚的物質的量比1∶1∶1，但是，衍生化試劑比例的增加有利于亞硝酸根的反應以及偶氮化合物的合成。因此對亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、1-萘酚的比例進行優化。

由圖6可知，當亞硝酸鈉和對氨基苯磺酸用量比為1∶3時吸光度最高，誤差較小，且有兩條線在該處的吸光度相近，亞硝酸鈉和1-萘酚比例1∶3和1∶7。考慮到節約試劑與保護環境的因素，后續實驗選取亞硝酸鈉和1-萘酚比例為1∶3。綜合考慮，選擇亞硝酸鈉-對氨基苯磺酸-1-萘酚物質的量比為1∶3∶3。

圖6 衍生化試劑用量的優化Fig.6 Optimization of the amount of derivatization reagent

2.3 膜富集實驗條件優化

2.3.1 微孔濾膜種類的選擇

按1.3.2節方法，使用2 mL質量濃度為8 mg/L亞硝酸鈉溶液，經過反應過后，稀釋至100 mL，取10 mL，分別過4 種常用微孔濾膜，即MCE、PVDF、Nylon、CA，考察富集偶氮化合物的性能。如圖7所示，Nylon-A和Nylon-B兩個廠家的尼龍膜對偶氮化合物有較好的富集效果，同時不同廠家的濾膜吸光度相差不大，但Nylon-B偏差較小。其他種類的膜材料或沒有明顯富集效果或光譜信號很弱。后續實驗中選擇Nylon-B對偶氮化合物進行富集。

圖7 4 種濾膜富集偶氮化合物的對比圖Fig.7 Comparison of enrichment of azo compounds using four kinds of filters

2.3.2 富集溶液體積的選擇

設計實驗考察20 μg/L、pH 4.74的亞硝酸鈉衍生溶液，體積為1～20 mL范圍內膜富集的效果。按照1.3.2節的方法進行富集、測試，結果如圖8所示，隨著樣品體積從1 mL增加到7 mL，偶氮化合物472.5 nm波長處的吸光度明顯增加。當樣品體積從7 mL增加到15 mL時，偶氮化合物的吸光度增加不明顯。同時，由于溶液體積位于15 mL和20 mL時，誤差較大，故而選擇溶液體積為10 mL為后續實驗的樣品溶液過膜體積。

圖8 富集樣品溶液體積對偶氮化合物吸光度的影響（472.5 nm）Fig.8 Effect of sample volume on absorbance at 472.5 nm of azo compounds

2.4 漫反射光譜檢測條件優化

亞硝酸鈉溶液和對氨基苯磺酸和1-萘酚反應過后的酸性溶液先采用分光光度法測定其溶液特征峰，再富集到尼龍膜上測定漫反射光譜，2 種光譜圖如圖9所示，與文獻[27-28]結果相符，后續實驗選擇472.5 nm為分析波長。

圖9 偶氮化合物的分光光度光譜圖與富集化合物的膜固相光譜圖Fig.9 Diffuse reflectance spectra of free azo compounds and those enriched on the membrane

2.5 標準曲線和檢出限

在優化好的條件下，通過富集系列質量濃度與衍生化試劑反應得到的偶氮化合物標準溶液，探究亞硝酸鈉質量濃度在0.002～0.030 mg/L時與吸光度之間的關系。在0.002～0.030 mg/L質量濃度的范圍內，富集產物的最大吸光度與亞硝酸鈉質量濃度呈二次函數關系y=－268.76x2+14.55x+0.03，R2=0.999；在0.002～0.014 mg/L質量濃度范圍內，富集產物的最大吸光度與亞硝酸鈉質量濃度呈線性關系y=11.02x+0.03，R2=0.991。

利用9 次空白樣品計算其標準偏差，按3 倍標準偏差估算得出本實驗方法的檢出限為1.29 μg/L，定量限為4.30 μg/L。

標準溶液的檢出限為1.29 μg/L，根據自來水樣品前處理的計算，自來水的方法檢出限為12.90 μg/L，定量限為43.00 μg/L；根據培根樣品前處理的計算，培根的方法檢出限為1.29 mg/kg，定量限為4.30 mg/kg。

2.6 實際樣品的檢測結果

2.6.1 自來水中亞硝酸鈉的檢測

由于自來水中含有三價鐵離子，三價鐵離子容易和偶氮化合物的—N＝N—產生化學鍵合反應，4×10－6mol/L的三價鐵離子會使偶氮化合物吸光度降低53.8%[26]，故而先將自來水pH值調節至4.3，再使用中性濾紙過濾，用過濾后的自來水按照1.3.3節的實驗步驟進行反應，使用本方法未檢測出亞硝酸鈉，添加5.20、10.00、20.00 μg/L三種質量濃度的亞硝酸鈉溶液進行加標回收實驗，采集光譜數據進行分析，平行測定5 次。加標回收實驗結果見表1。

表1 本方法對自來水中亞硝酸鈉質量濃度的測定Table 1 Determination of NaNO2 concentration in tap water by the developed method

如表1所示，亞硝酸鈉在自來水中的回收率在91.3%～114.0%的范圍內，5 次平行實驗的相對標準偏差在4.21%～7.90%之間。該結果能夠滿足日常分析的實驗要求，證明了本研究使用的儀器和建立的方法在自來水中亞硝酸鈉檢測的準確性和實用性。

2.6.2 肉質品中亞硝酸鈉的檢測

肉質品選取從超市中購得的兩種培根進行亞硝酸鈉的檢測，用文獻的前處理方法[29]對樣品進行處理，獲得的培根提取液直接采取本實驗方法檢測；隨后對獲得的培根提取液進行離子色譜的檢測，檢測結果見表2。

表2 本方法與離子色譜檢測2 種培根的結果Table 2 Determination of nitrite in two types of bacon by the developed method and ion chromatography

由表2可以看出，實際樣品美式培根的亞硝酸鈉含量為7.60 mg/kg，雙匯培根的亞硝酸鈉含量為7.96 mg/kg，均低于國標[30]的要求（0.15 g/kg），平行實驗的相對標準偏差分別為8.51%、9.98%。該結果滿足日常分析需求，同時，本實驗方法相比于離子色譜這種大型精密儀器而言，在精密度和靈敏度不低于離子色譜的基礎上，日常維護少、分析速度快、攜帶便捷，證明該方法在檢測實際的肉制品中亞硝酸鈉含量時方法的準確性和實用性。

3 結 論

本研究建立一種基于膜固相萃取-漫反射可見光譜法對水質和肉制品中痕量亞硝酸鈉進行定量檢測的方法。該方法對國標中使用的衍生化試劑進行優化，并且結合膜富集的技術，具有膜固相萃取的簡便、快速、有機試劑使用少、靈敏度高、檢出限低、儀器造價成本低等優勢，實際樣品中的痕量亞硝酸鈉含量分析的結果較為準確，精密度也可以接受，研究方法為可見光譜應用于痕量物質的分析提供了可能。