基因重排檢測技術聯合玻璃體液中IL-10和IL-6檢測對PIOL的診斷價值

呂永川，彭金萍，管英朝，張 陽，張淑清，樹玲博 ，陶 勇

0引言

原發性眼內淋巴瘤(primary intraocular lymphoma, PIOL)是發生于眼內組織的淋巴瘤，屬原發性中樞神經系統淋巴瘤亞型，本病多見于老年人，以視物模糊、眼前黑影漂浮感為主要臨床表現[1]。PIOL病因復雜，臨床表現多樣，且無標準治療方案，數據報道約80%的患者隨著病情發展可累及中樞神經系統而致死，預后較差，及時診斷并開展放射治療、化學治療等方式是取得生存獲益的關鍵[2-3]。但PIOL可獲取的標本量相對較少，臨床診斷及病理診斷均存在困難。探索有效的PIOL診斷方式至關重要。淋巴細胞抗原受體基因重排是淋巴瘤的重要輔助診斷方式之一，但檢測過程復雜、影響因素繁雜，并在一定程度上影響檢測靈敏度[4]。玻璃體液及房水中細胞因子檢測也是PIOL的重要輔助診斷方式，有研究指出檢測眼內白介素-10(interleukin-6,IL-10)及IL-10/白細胞-6(interleukin-6,IL-6)比值可輔助診斷B細胞淋巴瘤[5-6]。鑒于此，本研究擬將基因重排檢測技術結合檢測玻璃體液IL-10、IL-6水平用于PIOL的診斷，分析其診斷價值，以期為PIOL的臨床診斷提供試驗依據。

1對象和方法

1.1對象回顧性分析。研究對象為2015-01/2019-12在本院收治的擬診PIOL患者27例，其中經診斷學玻璃體切割手術檢查確診PIOL 21例21眼，葡萄膜炎患者6例6眼。PIOL組中男11例，女10例，年齡31～75(中位數53)歲，均為彌漫大B細胞淋巴瘤。葡萄膜炎組中男4例，女2例，年齡25～69(中位數51)歲，前葡萄膜炎4例，全葡萄膜炎2例，急性期3例，慢性期3例。納入標準：(1)經診斷性玻璃體切割術病理檢查確診；(2)接受過基因重排檢測及玻璃體液中IL-10、IL-6水平，且檢測前未接受過藥物、手術等治療方式干預；(3)病歷資料完整。排除標準：(1)病理檢查確診為中樞神經系統淋巴瘤眼內轉移瘤；(2)雙眼病變；(3)全身其他系統性淋巴瘤病變。本研究符合《赫爾辛基宣言》相關要求。所有患者知情同意，經過醫院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑盒基因組DNA提取試劑盒購自根生化科技(北京)有限公司；基因測序平臺為Life Techplogy技術平臺；Lympho Track Dx IGH FR2 Assay基因重排檢測驗證試劑盒、Lympho Track Dx TCRG Assay基因重排檢測驗證試劑、IgH、TCRG基因重排檢測試劑盒均購自美國Invivo Scribe公司；酶聯免疫吸附法試劑盒購自尚柏生物醫學技術(北京)有限公司；Spectra Max i3x多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2.2基因重排檢測所有患者均接受玻璃體切割手術，未灌注時切除并收集核心玻璃體1.5～2.0mL，指壓方式維持相對穩定壓力，獲取標本后灌注平衡液維持眼內壓，切除剩余玻璃體。取玻璃體標本至Eppendorf管，基因組DNA提取試劑盒提取DNA，安捷倫4200評價所提取DNA質量，進行PCR擴增。擴增反應體：Master Mix 45μL，AmpliTaq Gold Taq 0.2μL，DNA 5μL，總體積50μL；擴增條件：95℃ 7min、95℃ 45s、60℃ 45s、72℃ 90s，循環數29個；72℃ 10min。而后采用AMPure XP方法純化PCR產物，安捷倫4200對DNA進行定量。NEXT-flex DNA Barcords及NEXTflex PCR free DNA測序試劑盒構建DNA文庫，乳液PCR制備模板，將文庫上載Ion 316芯片，上Ion PGM機測序，測序結束后將導出的FASTQ文件直接導入Lympho Track Dx PGM Software Dx軟件完成數據分析，將最終結果導入EXCEL表格；參照文獻[7]對結果進行克隆判定。

1.2.3細胞因子檢測取0.7～1.0mL玻璃體液至Eppendorf管，15 000r/min條件下離心10min，酶聯免疫吸附法測定玻璃體液中細胞因子IL-10(正常范圍0～50.0pg/mL)、IL-6(1.0～50.0pg/mL)水平；Spectra Max M45酶標儀測定各孔吸光度，波長450nm，以標準品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，計算玻璃體液中IL-10、IL-6含量。

統計學分析：采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，不符合正態分布數據采用P50(P25，P75)描述，兩組間比較采用非參數檢驗；計數資料采用例或百分比(%)描述；診斷價值采用受試者工作特征(ROC)曲線分析，ROC曲線下面積比較采用Z檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1上機測序及測序結果分析納入PIOL患者21例中，15例IhH FR2單克隆性重排序列，陽性率71%(15/21)，均可獲得基因重排的基因序列；4例檢出TCRG克隆性基因重排序列；其余6例標本未能檢出IgH FR2單克隆序列。而6例確診為葡萄膜炎的標本中均未見IhH FR2、TCRG單克隆性重排序列，FR2、TCRG均為多克隆性，DNA電泳圖見圖1。經ROC曲線分析顯示基因重排檢測PIOL的AUC為0.857(0.669～0.961)，Z=7.071，P<0.001；約登指數0.714，敏感性、特異性分別為71.43%、100.00%，見圖2。

表2 細胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析結果

圖1 組織DNA電泳圖 M：Marker；D1～D7：PIOL組；C1～C3：葡萄膜炎組。

圖2 基因重排檢測PIOL診斷PIOL的ROC曲線分析。

表1 兩組患者細胞因子水平檢測結果 P50(P25，P75)

圖3 細胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析。

2.3基因重排檢測聯合細胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析基因重排檢測陽性、IL-10>170.90pg/mL、IL-10/IL-6比值>1.95中滿足任意條件即判定為PIOL，經ROC曲線分析顯示基因重排檢測聯合細胞因子診斷PIOL的AUC為0.893(0.713～0.978)，Z=4.553，P<0.001，約登指數0.785，敏感性、特異性分別為95.24%、83.33%，見圖4。

圖4 基因重排檢測聯合細胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析。

3討論

PIOL屬非霍奇金淋巴瘤，且多數PIOL為B細胞來源，約占眼內及眼眶腫瘤的0.8/100 000[8]。當前國內并無PIOL的流行病學調查研究，但近年來受診斷技術提升、免疫缺陷患者增加等多因素影響，PIOL發病率有上升趨勢[9]。本病臨床表現缺乏特異性，被稱為偽裝綜合征的典型代表，臨床極易將其誤診為葡萄膜炎、鞏膜炎，診斷難度較大[10]。當前臨床對擬診PIOL的診斷流程也十分繁雜，一般先行MRI檢查，而后接受腰椎穿刺并行腦脊液檢查，若檢查結果為陰性則需完善診斷性玻璃體切割術獲得組織標本，若為陽性則診斷為PIOL；若為陰性則需進一步接受視網膜下或視網膜病變活檢。同時，在眼部活檢證實診斷后還需完善神經系統影像學檢查及腦脊液分析，一般PIOL患者的診斷可延遲8～21mo，且研究報道一般PIOL患者并病理學檢查確診后一般生存率僅為3～5a[11]。眼底自發熒光檢查、光學相干斷層成像等影像學輔助方式雖能有效評價疾病進程及預后，但診斷特異性不佳[12]。

研究報道，多數淋巴細胞增生性疾病通過組織形態學、免疫表型便可獲得確診，但仍有少部分淋巴瘤在經大量免疫標志檢測后依然難以鑒別良惡性。基于淋巴瘤的病生理特征，其是因淋巴細胞成熟阻滯于某個階段發生克隆性增生，所有細胞具有相同的重排方式，即克隆性重排，這也是克隆性增生和譜系來源的標志，且自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)/T細胞淋巴瘤中免疫球蛋白及T細胞受體(T cell receptor,TCR)基因多數呈胚系構型，無克隆基因重排，這也是免疫球蛋白及TCR基因克隆性重排則可作為淋巴瘤的重要輔助診斷方式的重要原因[13-14]。本研究中，15例IhH FR2單克隆性重排序列，陽性率71%(15/21)，均可獲得基因重排的基因序列；4例檢出TCRG克隆性基因重排序列；其余6例標本未能檢出IgH FR2單克隆序列。6例確診為葡萄膜炎的標本中均未見IhH FR2、TCRG單克隆性重排序列，FR2、TCRG均為多克隆性。經ROC曲線分析顯示基因重排檢測技術診斷PIOL的AUC為0.857，特異性高達100.00%，但敏感性欠佳，僅為71.43%。往期研究也報道[15]，IhH FR2單克隆性重排序列也并不意味著惡性，CD陽性T淋巴細胞增生等疾病也可出現淋巴細胞克隆性增生，也因PCR的高度敏感性，也可發生假克隆或寡克隆現象。因此，單純基因重排檢測技術診斷PIOL存在局限性。

IL-10、IL-6均是重要的免疫調節細胞因子。前者作為重要的多效免疫調節細胞因子，可通過抑制Th1細胞、INF-γ、IL-2來損害腫瘤免疫監視；不僅如此，IL-10還可刺激B淋巴細胞增殖分化，在淋巴瘤惡性發展中也扮演重要角色[16]。而IL-6則具多重性及復雜性，良惡性B淋巴細胞、良惡性T淋巴細胞均可產生IL-6，其參與機體生理性免疫調節及炎癥反應，當前研究已證實IL-6與淋巴細胞增生異常具緊密關聯，可作為淋巴細胞生長因子參與非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)發生及發展[17]。本研究顯示，PIOL患者玻璃體液中IL-10及IL-10/IL-6水平均顯著高于葡萄膜炎患者，但兩種病變患者IL-6水平差異無統計學意義，ROC曲線分析也顯示IL-6對PIOL無顯著診斷效能，可能與腫瘤細胞、炎癥均可增加IL-6分泌有關[18-19]。ROC曲線分析還顯示，IL-10診斷PIOL的AUC最高，特異性雖為100.00%，敏感性則僅為66.67%；IL-10/IL-6診斷的AUC略低于IL-10，特異性與IL-10相當，敏感性僅為52.40%。由此也可見，單一IL-10、IL-6等細胞因子檢測作為PIOL的診斷性生物標志物存在局限性。進一步應用基因重排檢測技術聯合細胞因子檢測診斷時，AUC高達0.893，敏感性、特異性分別為95.24%、83.33%。提示基因重排檢測技術聯合IL-10、IL-6等細胞因子檢測診斷PIOL可顯著提升診斷敏感性，且特異性良好。

綜上所述，玻璃體液IL-10、IL-10/IL-6可用于PIOL輔助診斷，但診斷敏感性欠佳現象，聯合應用基因重排檢測技術可明顯提升診斷敏感性，并獲得良好的特異性。考慮PIOL的大樣本研究罕見，本研究樣本量也僅為21例，基因重排檢測技術，尤其是細胞因子檢測在PIOL診斷中的應用仍有極大深入探究空間，以期在下階段采集充足樣本量后持續補充及完善。

1莫春艷, 張學東. 原發性眼內淋巴瘤的診斷及治療. 眼科新進展 2017;37(6):597-600